MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / SEPTIEMBRE 2023 / EDICIÓN 552 101 al análisis bioinformático, dándose la creación y clusterización de las unidades taxonómicas presentes en las muestras (Callahan et al., 2017; Edgar, 2018), también llamadas ZOTU (del inglés zero-radius operational taxonomic unit). Estos ZOTU constituyen la diversidad y composición de las poblaciones bacterianas de la muestra y cada uno representa, individualmente, los posibles taxones presentes en las muestras. La asignación taxonómica de los ZOTU es fundamental, ya que este paso permite ver, realmente, qué grupos bacterianos están presentes. De manera tradicional, en los análisis clásicos de 16S, las secuencias se comparan con otras presentes en una base de datos general, prediciendo a qué taxones puede pertenecer cada ZOTU (análisis predictivo). Para ello, los ZOTU obtenidos se comparan con entradas preestablecidas en bases de datos, en el caso de este proyecto se usaron dos bases de datos, una de uso general: GreenGenes (DeSantis et al., 2006) y otra específica para minería: Helix Bioinformatics Solutions S.L, 2021, la cual es un desarrollo propio de Helix BioS. Este doble filtrado de datos permitió obtener la mejor resolución taxonómica posible. A continuación, se realizaron dos pasos de depuración o limpieza de datos. En el primero se trató de excluir de los análisis aquellos ZOTU cuyas secuencias pertenecían a cloroplastos y mitocondrias, para mantener aquellas secuencias genuinamente procariotas y aquellos ZOTU no identificados a nivel de filo. El segundo consistió en filtrar de forma inespecífica todos aquellos ZOTU cuya abundancia total fuese inferior o igual a 25 lecturas en el conjunto de las muestras, consiguiendo así reducir el ruido técnico generado por la secuenciación de artefactos. A partir de del conjunto de ZOTU filtrados se realizaron los análisis posteriores de diversidad y composición microbiológica (Garris et al., 2016; Hugerth & Andersson, 2017). Para la descripción-analítica de la biodiversidad y de la composición microbiana de las muestras, se utilizó el software estadístico R v3.6.2 (R Core Team, 2019) y las librerías vegan 2.5-7 (Dixon, 2003), phyloseq 1.30.0 (McMurdie & Holmes, 2013); mientras que, para el análisis de bioindicadores, se utilizó la librería DESeq2 1.26 (Love et al., 2014). Los siguientes índices de diversidad alfa se calcularon con las muestras: Riqueza (S), Índice de Chao1 (Chao1), Índice de Shannon-Wiener (H), Índice de Diversidad Filogenética (PD) e Índice inversa de Simpson (1/D). Un aspecto importante en el análisis de la microbiota es el estudio de la composición microbiana, es decir, qué taxones y con qué frecuencia se hallan presentes en las muestras. Para ello, se trabajó con dos tipos de abundancias: la abundancia absoluta observada o recuento (n) y la abundancia relativa observada o proporción (%). Figura 3. Abundancia relativa observada (%) de los filos de procariotas. Cada barra vertical representa una muestra (N=13). Se presentan los filos más abundantes en todas las muestras y los taxones con una abundancia global inferior al 1% fueron colapsados en una sola categoría nombrada como “Otros” (en gris). Figure 3. Observed relative abundance (%) of prokaryote phyla. Each vertical bar represents one sample (N = 13). The most abundant phyla in all samples are shown and taxa with an overall abundance of less than 1% were collapsed into a single category named "Other" (in gray). process was carried out in two phases, followed by quality control. The first phase is sequencing in Illumina Miseq 2x300, where the libraries were loaded in cartridges (flow cells), in order to obtain an average result between 100,000 to 150,000 reads per sample and amplicon, verifying that the average number of reads per sample in this project was 102,235, as a quality control of the process. Finally, more than 90% of the bases and readings far exceeded the threshold of 20 on the Phred scale, with the average quality being close to 30 in this project. Subsequently, the data were subjected to bioinformatic analysis, leading to the creation and clustering of taxonomic units present in the samples(Callahan et al., 2017; Edgar, 2018), also called ZOTU (zero-radius operational taxonomic unit). These ZOTU are an approximation to the diversity and composition of the bacterial populations in the sample and each one represents, individually, each of the possible taxa present in the samples. The taxonomic assignment of the ZOTU is fundamental, as this step allows to really see which bacterial groups are present in the sample. Traditionally, in classical 16S analyses, sequences are compared with others present in a general database, predicting to which taxa each ZOTU may belong (predictive analysis). For this, the ZOTU obtained are compared with pre-established entries in these databases. In the case of this project, two databases were used, one for general use (GreenGenes) (DeSantis et al., 2006) and another one specific for mining(Helix Bioinformatics Solutions S.L,
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