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EVALUACIÓN DE LA METAGENÓMICA COMO HERRAMIENTA NOVEDOSA PARA EL MONITOREO AMBIENTAL Y BIORREMEDIACIÓN DE ÁREAS DISTURBADAS POR

Por: Virginia Sebastián, Carlos Garrido-Allepuz, José María Lezcano, Marcos Garayar y Manuel Li, de Helix BioS; Pedro Delvasto, de la Universidad Industrial de Santander (Colombia) y Guillermo Shinno de Anabi.


Resumen

En el presente trabajo se tomaron trece muestras de aguas y suelos en sitios afectados y sin afectar por la actividad minera, en un ambiente minero real del altiplano peruano, específicamente en el tajo Anama de la minera Anabi, ubicada en el distrito de Huaquirca, provincia de Antabamba, departamento de Apurímac. Se diferenció entre muestras afectadas directamente por la actividad minera (tajo) y muestras provenientes de zonas no sometidas a la actividad minera (entorno natural), pero dentro de las inmediaciones de la mina. Se extrajo el material genético (ADN ambiental) de las muestras y se sometió a secuenciación NGS, específicamente del ARN ribososómico 16S, el cual permite identificar bacterias. Mediante técnicas de bioinfomática fundamentadas en la metagenómica, se identificaron taxonómicamente, a nivel de género y especie, las bacterias presentes en las muestras. Mediante procedimientos bioestadísticos, se establecieron los índices de diversidad, los bioindicadores y otros datos ecológicos de interés en las muestras. Los resultados muestran la presencia de microorganismos oxidantes de hierro y azufre, asociados con procesos de generación de aguas ácidas dentro de la mina, así como numerosos géneros con capacidad de trabajar en anaerobiosis, los cuales pueden actuar como microorganismos sulfato reductores y fermentadores, generando eventuales sinergias, las cuales podrían aprovecharse para el diseño de procedimientos de biorremediación dentro de la propia mina. El estudio demuestra la importancia de aplicar la metagenómica dentro del conjunto de acciones ambientales que acompañan a la actividad minera.

Introducción 

Antes de emprender cualquier proyecto minero, es fundamental llevar a cabo un exhaustivo estudio de impacto ambiental que incluya una línea base biológica. Este proceso integral abarca desde la etapa de exploración hasta el cierre de las minas y comprende el cálculo de reservas, el diseño de las operaciones mineras y la mitigación de impactos negativos (Rodríguez-Luna et al., 2022). Estas evaluaciones detalladas permiten identificar los posibles efectos en los ecosistemas locales y proporcionan un marco para implementar medidas preventivas y correctivas, garantizando así una gestión responsable y sostenible de la minería. 

En el contexto de un estudio de impacto ambiental para proyectos mineros, los aspectos biológicos desempeñan un papel crucial en la evaluación de los impactos potenciales. Al desarrollar una línea base biológica, es fundamental abordar aspectos como la diversidad y distribución de especies vegetales y animales, incluyendo especímenes en peligro de extinción o endémicos. Además, se deben considerar los hábitats clave, como bosques, humedales o ecosistemas acuáticos, así como los corredores biológicos y las áreas de reproducción o migración. Los estudios también deben incluir análisis de la calidad del agua, suelos y sedimentos, así como el monitoreo de la flora y fauna durante diferentes estaciones y ciclos. La identificación y evaluación de los efectos directos e indirectos de la actividad minera en estos aspectos biológicos son esenciales para establecer estrategias de mitigación y conservación efectivas (Gwimbi & Nhamo, 2016). 

Ignorar o pasar por alto los aspectos microbiológicos de un ecosistema al establecer un estudio de línea base para un proyecto minero puede tener implicaciones significativas, normalmente de índole negativa. Los microorganismos desempeñan un papel vital en los ciclos biogeoquímicos, la descomposición de la materia orgánica, la fertilidad del suelo y la calidad del agua (Dabolkar et al., 2023; Ezeokoli et al., 2020; Sari et al., 2023; Yuan et al., 2021). Además, algunos microorganismos pueden ser indicadores de la salud ambiental y la presencia de contaminantes. Al no considerar los aspectos microbiológicos, se corre el riesgo de subestimar o ignorar los impactos potenciales de la actividad minera en la microbiota del suelo, el agua y los ecosistemas acuáticos. Esto podría llevar a una falta de comprensión de los efectos reales y a la falta de implementación de medidas de mitigación adecuadas. Además, las consecuencias pueden extenderse a la salud humana y a la sostenibilidad a largo plazo del proyecto minero. Por lo tanto, es fundamental incluir una evaluación microbiológica en la línea base para una comprensión integral y precisa de los impactos ambientales de la minería. 

La metagenómica es una disciplina científica que se enfoca en el estudio del material genético presente en muestras ambientales, como suelos, sedimentos y agua. A través de técnicas avanzadas de secuenciación de ADN, la metagenómica permite analizar y caracterizar la diversidad microbiana en un ecosistema sin la necesidad de cultivar individualmente cada microorganismo (Offiong et al., 2023). En el contexto de los estudios de línea base en proyectos mineros, la metagenómica es una herramienta invaluable. Permite detectar y describir la composición y función de las comunidades microbianas en los ecosistemas afectados por la minería, así como identificar microorganismos resistentes o indicadores de contaminación (Romero et al., 2021). Esto brinda información esencial para evaluar los impactos ambientales y desarrollar estrategias de mitigación efectivas, al tiempo que proporciona una visión más completa y precisa de la salud y resiliencia del ecosistema frente a las actividades mineras. La metagenómica, al develar el potencial microbiano y su respuesta a la minería, se convierte en una valiosa herramienta para promover una gestión responsable y sostenible de estos proyectos (Sari et al., 2023).

Ahora bien, la metagenómica no solo permite perfeccionar los estudios de línea base biológica en las primeras etapas del proyecto minero. Merece la pena preguntarse si en operaciones ya existentes es posible aplicarla y qué información útil puede proporcionar al momento de tomar decisiones de gestión ambiental durante la vida de la mina. En este contexto, el monitoreo ambiental continuo y la implementación de medidas de mitigación son fundamentales para minimizar los impactos sobre los ecosistemas (Offiong et al., 2023). Asimismo, tomar decisiones críticas durante el cierre progresivo de las minas y la remediación ambiental es de vital importancia para garantizar una recuperación efectiva. En este sentido, la metagenómica se presenta como una herramienta invaluable al proporcionar información detallada y actualizada sobre la diversidad y función microbiana en los sitios mineros. 

Mediante técnicas de secuenciación de ADN de nueva generación, la metagenómica permite identificar microorganismos resistentes a los metales pesados, evaluar la capacidad de remediación natural y diseñar estrategias individualizadas de rehabilitación del ecosistema (Dabolkar et al., 2023). Esta información precisa ayuda a tomar decisiones informadas en cuanto al tratamiento de aguas contaminadas, la implementación de coberturas de suelos o tecnosuelos y la optimización de prácticas de remediación. Al aprovechar la metagenómica, las empresas mineras pueden elevar su nivel de innovación y comprometerse con el mejoramiento del medio ambiente y la sociedad circundante. La recuperación de servicios ecosistémicos se vuelve más efectiva y sostenible, promoviendo así una minería responsable y contribuyendo al desarrollo sostenible en el largo plazo (Garris et al., 2016).

En un trabajo previamente publicado, se demostró el poder de la metagenómica para explicar, desde una perspectiva integral, el aporte de esta herramienta (Sancho et al., 2022). En el mismo, se estableció una metodología de análisis de datos propia, que permitió analizar, a su vez, datos de ADN ambiental recogidos en el sistema de tratamiento de aguas de una mina de cobre china por (Yuan et al., 2021) y en suelos de una antigua mina de carbón en Sudáfrica (Ezeokoli et al., 2020). El análisis presentado (Sancho et al., 2022), indicó como las poblaciones microbiológicas del ecosistema se erigen como fieles marcadores de su salud y, además, cómo puede medirse cuantitativamente el incremento de la capacidad de prestación de servicios ecosistémicos de los suelos de un área rehabilitada luego de la explotación minera, empleando para ello herramientas metagenómicas. A pesar de estos buenos antecedentes, a la fecha aún no hay datos disponibles acerca de la biodiversidad o el análisis de ecosistemas de microambientes en zonas mineras del Perú.

Teniendo en cuenta la realidad anterior, en el presente trabajo de investigación aplicada se presenta, por primera vez, la caracterización microbiológica de diversos microambientes dentro de una operación minera en plena producción, en el Perú. En específico, se trata del análisis metagenómico de aguas y suelos muestreados directamente de zonas disturbadas por la minería y zonas aledañas no afectadas, localizadas en el tajo Anama de la empresa minera Anabi, ubicada en el distrito de Huaquirca, provincia de Antabamba, departamento de Apurímac. Con las muestras de zonas no afectadas, se pretende levantar una línea base microbiológica, la cual permita diferenciar los efectos de la minería en este entorno particular. Los resultados obtenidos permitieron establecer diversas relaciones ecosistémicas existentes e identificar bioindicadores del proceso de contaminación ambiental dentro del tajo. El estudio muestra como la metagenómica constituye una herramienta novedosa que posibilita visualizar de una manera efectiva cómo son los ecosistemas microbianos en un ambiente afectado por la minería y permite evaluar de forma realista la salud de dichos ecosistemas. 

Objetivos 

Dado lo anterior, el presente trabajo tuvo por finalidad la aplicación de la metagenómica en un ambiente minero real del altiplano peruano, considerando los siguientes tres objetivos específicos: 

(I) Validar la aplicabilidad de la metagenómica como una potente herramienta para determinar el impacto de la actividad minera sobre la biodiversidad microbiológica de suelos y aguas dentro de la operación.

(II) Identificar microorganismos nativos relevantes implicados en los procesos de alteración geoquímica que conducen a la generación de aguas ácidas.

(III) Identificar, a través de una bioprospección, aquellos microorganismos nativos que puedan ser utilizados para el diseño de soluciones de biorremediación in situ.

Desarrollo y colección de datos

Se procedió a la toma de muestras tanto de agua como de suelo contaminados y no contaminados. Se consideró la categoría “no contaminado” a zonas no afectadas por la actividad minera, pero ubicadas dentro del recinto de la mina, mientras que las muestras catalogadas como “contaminadas” pertenecían a lugares afectados directamente por la actividad minera. Se tomaron muestras para las aguas contaminadas (AC) de dos lugares diferentes por duplicado, para las aguas no contaminadas (ANC) se tomó muestras de un único sitio por triplicado. Para el suelo contaminado (SC) se tomó una muestra de tres sitios diferentes del tajo, mientras que para las muestras de suelo no contaminado (SNC) se muestreó una misma zona, por triplicado. Así las cosas, se obtuvo un total de trece muestras a procesar. El volumen de muestra fue de 50 ml para suelos y 250 ml para aguas. En la Tabla 1, se recopila la relación de las muestras colectadas, así como las coordenadas del lugar de recogida tanto en las coordenadas originales (UTM) como en las coordenadas en Grados (DMS). La Figura 1 ilustra los sitios de muestreo y sus características.

La extracción de ADN se llevó a cabo mediante kits específicos para muestras ambientales, usando los kits de Qiagen DNeasy PowerSoil y DNeasy PowerMax Soil, siguiendo los protocolos marcados por el fabricante en los respectivos manuales. Los kits de Qiagen para muestras ambientales incluyen el Inhibitor Removal Technology, capaz de eliminar diferentes tipos de ácidos, compuestos polifenólicos, metales pesados y otros elementos que pudieran estar presentes en las muestras.

Los estudios de metagenómica bacteriana se realizan analizando las regiones hipervariables del gen de ARN ribosómico 16S procariótico (16S rRNA gene). Las regiones que mejor discriminan la microbiota, en general, son la región hipervariable 3 (V3) y la región hipervariable 4 (V4) (Wang & Qian, 2009). Para este proyecto, se usó la región que comprende desde el comienzo de la V3 hasta el final de la V4, amplicón conocido como V3-V4. Para llevar a cabo la construcción de las librerías para ambas regiones, se procedió de acuerdo con los protocolos estándar de Illumina y de los kits de librerías. El proceso de secuenciación se llevó a cabo en dos fases, seguidas de un control de calidad. La primera fase es la secuenciación en Illumina Miseq 2x300, donde las librerías se cargaron en cartuchos (flow cells), con el fin de obtener un resultado promedio entre 100,000 a 150,000 lecturas por muestra y amplicón, verificándose que el promedio de lecturas por muestra en este proyecto fue de 102,235, a modo de control de calidad del proceso. Finalmente, más del 90% de las bases y lecturas superaron con creces el umbral de 20 de puntuación en la escala Phred, siendo la calidad media cercana a 30 en este proyecto. Posteriormente, los datos pasaron al análisis bioinformático, dándose la creación y clusterización de las unidades taxonómicas presentes en las muestras (Callahan et al., 2017; Edgar, 2018), también llamadas ZOTU (del inglés zero-radius operational taxonomic unit). Estos ZOTU constituyen la diversidad y composición de las poblaciones bacterianas de la muestra y cada uno representa, individualmente, los posibles taxones presentes en las muestras. La asignación taxonómica de los ZOTU es fundamental, ya que este paso permite ver, realmente, qué grupos bacterianos están presentes. De manera tradicional, en los análisis clásicos de 16S, las secuencias se comparan con otras presentes en una base de datos general, prediciendo a qué taxones puede pertenecer cada ZOTU (análisis predictivo). Para ello, los ZOTU obtenidos se comparan con entradas preestablecidas en bases de datos, en el caso de este proyecto se usaron dos bases de datos, una de uso general: GreenGenes (DeSantis et al., 2006) y otra específica para minería: Helix Bioinformatics Solutions S.L, 2021, la cual es un desarrollo propio de Helix BioS. Este doble filtrado de datos permitió obtener la mejor resolución taxonómica posible. 

A continuación, se realizaron dos pasos de depuración o limpieza de datos. En el primero se trató de excluir de los análisis aquellos ZOTU cuyas secuencias pertenecían a cloroplastos y mitocondrias, para mantener aquellas secuencias genuinamente procariotas y aquellos ZOTU no identificados a nivel de filo. El segundo consistió en filtrar de forma inespecífica todos aquellos ZOTU cuya abundancia total fuese inferior o igual a 25 lecturas en el conjunto de las muestras, consiguiendo así reducir el ruido técnico generado por la secuenciación de artefactos. A partir de del conjunto de ZOTU filtrados se realizaron los análisis posteriores de diversidad y composición microbiológica (Garris et al., 2016; Hugerth & Andersson, 2017). Para la descripción-analítica de la biodiversidad y de la composición microbiana de las muestras, se utilizó el software estadístico R v3.6.2 (R Core Team, 2019) y las librerías vegan 2.5-7 (Dixon, 2003), phyloseq 1.30.0 (McMurdie & Holmes, 2013); mientras que, para el análisis de bioindicadores, se utilizó la librería DESeq2 1.26 (Love et al., 2014). Los siguientes índices de diversidad alfa se calcularon con las muestras: Riqueza (S), Índice de Chao1 (Chao1), Índice de Shannon-Wiener (H), Índice de Diversidad Filogenética (PD) e Índice inversa de Simpson (1/D).

Un aspecto importante en el análisis de la microbiota es el estudio de la composición microbiana, es decir, qué taxones y con qué frecuencia se hallan presentes en las muestras. Para ello, se trabajó con dos tipos de abundancias: la abundancia absoluta observada o recuento (n) y la abundancia relativa observada o proporción (%).

Presentación y discusión de resultados 

La diversidad es una propiedad emergente de las comunidades biológicas que se relaciona con la variedad dentro de ellas. Este atributo es la expresión de dos componentes: el número de especies presentes en la comunidad, riqueza, y la equidad, que describe cómo se distribuye la abundancia de los individuos entre las distintas especies que integran la comunidad (Tuomisto, 2012). En un contexto como este, de análisis de amplicones o metabarcoding, dichos índices se estiman a partir de la tabla de ZOTU limpia y filtrada. En la Tabla 2 se muestran los resultados del análisis de biodiversidad utilizando varios índices de diversidad alfa. Los dos primeros conceptualizan el término de riqueza, estos índices fueron la riqueza observada (S) o número total de ZOTU contabilizados y un índice basado en la riqueza estimada, Chao-1, en concreto, de media se estimó la riqueza en 72 (DE 140) ZOTU y en 72 (DE 140) ZOTU para Chao-1. La muestra con una mayor riqueza, superior claramente al resto, fue SNC1-2 con 531 ZOTU, las segunda y tercera muestras con mayor riqueza fueron: AC2-1 con 95 ZOTU y SC1-1 con 75 ZOTU. Las muestras con menor riqueza observada fueron SC2-1, SC3-1 y ANC1-1 con 10, 10 y 14 ZOTU, respectivamente. El resto de los índices representan la diversidad en la muestra, para estos se obtuvieron los siguientes valores medios para el conjunto de las muestras: índice de Shannon (H) fue de 2.70 (DE 1.00); para el índice PD, que además tiene en cuenta las distancias filogenéticas entre ZOTU, fue de 12.36 (DE 11.95); finalmente, para 1/D fue de 16.69 (DE 33.87). Igualmente la misma muestra que presentó una alta riqueza, SNC1-2, también presentó los valores más altos para el resto de los índices de diversidad estudiados. En cuanto al análisis multivariante con los índices de alfa diversidad respecto a las condiciones de estudio, primero, se comprobó la normalidad de los datos, al no cumplir este requisito, se aplicaron técnicas no paramétricas como Kruskal-Wallis y Wilcoxon para evaluar posibles asociaciones entre estos índices biológicos y las condiciones experimentales, corrigiendo por múltiples comparaciones. Se evaluaron si existían diferencias estadísticamente significativas entre las muestras contaminadas (AC+SC) frente a las muestras no contaminadas (ANC+SNC) independientemente del material de soporte de la muestra (agua o suelo), no hallándose ningún índice significativo. Por lo que se procedió a comparar dentro del mismo soporte, buscando diferencias respecto a la contaminación, no hallándose tampoco diferencias ni en riqueza ni en diversidad entre AC vs ANC y entre SC vs SNC. 

Aparte de los índices de diversidad alfa, existen otros indicadores ecológicos, llamados índices de diversidad beta que evalúan la biodiversidad entre grupos de muestras definidos por las variables experimentales (Gotelli & Colwell, 2001). En este caso, se estudió la posible asociación entre los microorganismos detectados y el tipo de muestra (AC/ANC/SC/SNC), con el fin de detectar diferencias en cuanto al perfil microbiano usando el índice de disimilitud filogenético UniFrac Ponderado. Con la matriz de distancias, se realizó la prueba de Permanova, llevándose a cabo 999 permutaciones y corrección por comparaciones múltiples mediante FDR (p<0,05). Asimismo, se comprobó la homocedasticidad de las varianzas de manera multivariante y, una vez obtenida la matriz de distancias, se aplicó el método de ordenación denominado análisis de coordenadas principales o PCoA. Los grupos fueron homogéneos (p=0.340), sin embargo, no se detectaron diferencias entre las comunidades microbianas de las cuatro condiciones evaluadas (p=0.550), como se corrobora en la Figura 2, donde se muestra la disposición de las muestras en el sistema de ordenación PCoA (Figura 4), no se observan grupos de muestras en función de sus características. Como se puede comprobar las muestras SC se encuentran alejadas entre sí mostrando que tienen perfiles microbianos diversos, en cuanto a las muestras de agua (AC y ANC), excepto un duplicado, se encuentran agrupadas, pero junto con muestras de suelo no contaminado (SNC). El máximo de variabilidad explicada fue del 60%. Aunque la variabilidad explicada por las dos primeras componentes fue alta, esto no genera agrupaciones de muestras claras. En conclusión, la riqueza que se obtiene es esperable para este tipo de ecosistemas, caracterizados por no tener muchas especies diferentes, se esperaría que en las muestras no contaminadas fuera mayor ya que en principio, son muestras “naturales”, sin embargo, este no es el caso, hay una falta de riqueza excepto para la muestra SNC1-2, que, en este contexto, se podría considerar como un outlier. Igual pasa con la diversidad, al no observarse diferencias entre condiciones y asociar alguno de estos índices a una condición en particular y poder utilizarlos como indicadores ecológicos. El mismo resultado ha arrojado el estudio de la biodiversidad mediante el índice de UniFrac Ponderado, descartando que las categorías presenten un perfil microbiano lo suficientemente diferencial.

Un aspecto importante en el análisis de la microbiota es el estudio de la composición microbiana, es decir, qué taxones y con qué frecuencia se hallan presentes en las muestras (Lin & Peddada, 2020). Para ello, se trabajó con dos tipos de abundancias: la abundancia absoluta observada o recuento (n) y la abundancia relativa observada o proporción (%). La abundancia absoluta se calculó teniendo en cuenta el recuento de las lecturas por cada taxón detectado a los diferentes niveles taxonómicos evaluados. Este recuento se obtiene sumando las lecturas de los ZOTU que pertenezcan al mismo taxón. La abundancia relativa se obtuvo estimando las proporciones de cada taxón, esto es, dividiendo el recuento obtenido por cada taxón por muestra por el recuento total de lecturas en dicha muestra. Para el cómputo total de lecturas por muestra, se excluyeron de su cálculo aquellos taxones sin taxonomía informativa, esto es, las proporciones estimadas fueron las proporciones válidas. La abundancia relativa observada en proporciones medias se representó visualmente mediante gráficos de barras apiladas, siendo cada barra una muestra, para los siete órdenes taxonómicos, en tanto por cien. Para los órdenes taxonómicos de filo, clase, orden, familia, género y especie, además, se creó una nueva categoría que recogió a todos aquellos taxones que presentaron en la totalidad de las muestras, frecuencias inferiores al 1% por lo que la nueva categoría se nombró como “Otros: < 1%”. En las Figuras 3 a 8, se visualizan los resultados de la composición microbiana de las trece muestras analizadas. 

Al nivel de reino, la abundancia de las lecturas se repartió entre dos: Archea (0.03%) y Bacteria (99.97%), llevándose a la práctica la totalidad de las lecturas. Solo se detectaron arqueas en las muestras de suelo no contaminado, en concreto, en la muestra SNC1-2, la que mayor riqueza obtuvo. A nivel de filo, los más abundantes fueron Actinomycetota (37.55%), Bacillota (=Firmicutes) (34.24%), y Proteobacteria (16.99%), el resto de los filos tuvieron una representación inferior al 5% en el conjunto total de muestras. Se detectaron un total de 23 filos diferentes. Las muestras AC y SC presentaron un mayor porcentaje medio de abundancia del filo Bacillota (41.14% y 34.66%, respectivamente), siendo el primer filo en estas categorías, a diferencia de las muestras de agua y suelos no contaminados (ANC y SNC) cuyo primer filo fue el Actinomycetota con un 47.80% y 32.56%, respectivamente. En cuanto a clase, se detectaron hasta 58 clases diferentes, destacando: Actinomycetes (36.95%), Bacilli (28.49%), Gammaproteobacteria (8.4%), Alphaproteobacteria (3.76%), Clostridia (3.56%), Betaproteobacteria (3.47%). El resto presentaron abundancias medias inferiores al 3%. Se detectaron un total de 77 órdenes diferentes, destacando en abundancia media los órdenes Actinomycetales (38.02%), Caryophanales (17.64%), Lactobacillales (5.78%) y Pseudomonadales (4.87%), el resto presentó una proporción media inferior al 5%. A nivel de familia, destacaron las familias Pseudonocardiaceae (28.62%), Bacillaceae (10.98%), Nocardiopsaceae (8.22%) y Lactobacillaceae (4.73%). Se detectaron un total de 109 familias. El resto presentaron abundancias medias inferiores al 5%. En cuanto a géneros, se detectaron un total de 98 géneros diferentes, siendo el más abundante el género Prauserella (36.87%), presente en las muestras de AC (45.30%), en muestras de ANC (60.25%) y en muestras de SNC (37.22%), pero en muy baja abundancia en muestras de SC (1.91%). Seguido de otros géneros, pero con una abundancia media menor global, Lactobacillus (5.77%), siendo mayor este en las muestras SC (19.14%), pero no en las muestras de AC, ANC y SNC (3.71%, 0.89% y 0.00%, respectivamente); los géneros Citrobacter (4.42%), Propionibacterium (3.49%), Clostridium (3.36%), Corynebacterium (3.20%), Hydrogenophaga (3.16%), Pseudomonas (3.02%), el resto de géneros representan menos de un 3% de promedio en el conjunto total de las muestras. Finalmente, se llega a especie, identificándose hasta un total de 97 especies diferentes, siendo la Citrobacter farmeri (14%) la que mayor abundancia media obtuvo, seguida de la Rubrobacter bracarensis (11.08%) y la especie Hydrogenophaga soli (7.36%), el resto obtuvieron abundancias medias inferiores al 5%. Hay que tener en cuenta que, a este nivel, el grado de asignación taxonómica fue del 25%, es por ello, que se ha escogido el nivel de género para el resto de los análisis de la abundancia. 

En cuanto a géneros interesantes, relacionados con ambientes acidificados, que se han podido detectar fueron: Acidibrevibacterium (0.25%), acidófila aislada del agua de drenaje de mina; Acidiferrimicrobium (0.25%), acidófila aislada agua de drenaje de minas de carbón; Acidiphilium (0.29%), acidófila aislada del agua de drenaje de mina; Acidisphaera (0.24%). acidófila aislada del agua de drenaje de mina y aguas termales; Acidithiobacillus (0.87%, en concreto la especie A. ferrivorans como sulfato-oxidante; Anoxybacillus (0.89%), aislada en aguas termales ácidas; Desulfosporosinus (0.04%), anaerobia estricta sulfato reductora; Gallionella (0.15%, especies de este género son capaces de fijar CO2 a partir soluciones minerales salinas con sulfuro de hierro; Metallibacterium (0.16%), anaerobia facultativa ácido-tolerante aislada de un biofilm ácido de una mina de pirita, y Sulfobacillus (0.01%), acidófila aislada de concentrados de oro con sulfuro.

El análisis de abundancia es uno de los principales métodos utilizados para determinar diferencias en cuanto a la composición microbiana entre condiciones o grupos de muestras e identificar los taxones microbianos asociados con ciertos factores ambientales, biológicos y/o clínicos, a este tipo de taxones altamente diferenciadores, se les denomina bioindicadores. Se aplicó la librería DESeq2 siendo el objetivo detectar posibles filotipos candidatos a ser bioindicadores de las condiciones AC, ANC, SC, SNC, a través de comparar categorías dos a dos para determinar qué géneros se encontraban diferencialmente abundantes en la condición de interés respecto a la condición de estudio, aplicando un modelo binomial negativo ajustado a datos de secuenciación masiva de amplicones, con una estimación de la medida de efecto mediante la media geométrica, aplicando un modelo local con un conteo por poscount, con corrección por comparaciones múltiples mediante FDR (p<0.05) y fijando para el LFC [logaritmo del Fold-Change (FC) como medida de efecto] en cero (Tabla 3; Figuras 9, 10 y 11) (Lin & Peddada, 2020).

Por su parte, en la Figura 12 se refleja la abundancia relativa media (%) para cada categoría (AC/ANC/SC/SNC) de los géneros que se obtuvieron como significativos en los dos anteriores análisis estadísticos para las zonas contaminadas, así como ciertos géneros asociados a ambientes mineros de interés.

En conclusión, mediante los análisis de abundancia se han podido identificar determinados géneros asociados a las zonas contaminadas de manera significativa, pudiendo dar pie a ser propuestos como candidatos como bioindicadores de estas condiciones ambientales y que se tendrá que evaluar con mayor precisión con un mayor número de muestras, así como, recoger muestras de zonas no muestreadas que presenten características semejantes a las del tajo de Anama y zonas “naturales” alejadas del radio de acción de la actividad minera de la zona.

Comentarios e implicaciones de estos resultados hacia una gestión ambiental más efectiva en el sistema minero

Los resultados mostrados, si bien corresponden al análisis de pocas muestras de limitados ambientes del tajo Anama, dan cuenta del poder de la metagenómica para describir la ecología y la biodiversidad de los microambientes de un sistema minero. Las implicaciones de estos hallazgos son múltiples, ya que permiten identificar bioindicadores (Yuan et al., 2021) para describir efectos ecosistémicos indeseables en el sistema minero, vislumbrar cómo se puede acompañar este conocimiento con el diseño de nuevos procesos de remediación de ambientes afectados por la minería, hacer un mejor seguimiento de procesos de cierre de mina o complementar el monitoreo ambiental realizado en la actualidad.

En primera instancia, se encontraron resultados interesantes referentes a la biodiversidad de los ambientes mineros analizados. En términos generales, la riqueza y diversidad de estos resultaron ser bajas, posiblemente porque se trate de ambientes oligotróficos (pobres en nutrientes), psicrófilos y extremos en altitud y acidez. No obstante, a pesar de lo que podría pensarse a priori, la mayoría de las muestras mostraron una biodiversidad similar, sin importar si se tratase de muestras de suelo o agua “contaminadas” o “no contaminadas”, como se explicó líneas arriba y se muestra en la Figura 2. La mayor diferencia entre muestras se verificó en las de “suelo contaminado” extraídas de diferentes puntos del tajo Anama, lo cual da cuenta de la gran distancia entre los distintos puntos de muestreo, como se aprecia en la Figura 1. No obstante, se identificaron diferencias en algunas de las muestras duplicadas, obtenidas en principio de los mismos puntos, como fue el caso de las muestras AC2-1 y SNC1-2, esta última siendo la que mayor biodiversidad presentó. Estas diferencias podrían responder a la técnica de muestreo o a la selección del lugar específico. Por tanto, estas divergencias indican que, en futuros proyectos, debe incrementarse sustancialmente el número de muestras para establecer la significancia estadística de este tipo de variaciones y, por protocolo, identificar y definir de manera cohesionada, coherente y sistemática la clasificación de zonas (p. ej. tanto en “contaminadas” como “no contaminadas” o “naturales”), con el objeto de disminuir el sesgo de observación inherente a una clasificación subjetiva del lugar de muestreo, siendo extensible esta última recomendación a todo tipo de variables o factores que impliquen un observador u observadores como método de clasificación. 

Adicionalmente, la técnica permitió identificar, con suficiente diferenciación estadística, diversos indicadores microbiológicos, los cuales, a falta de datos relativos con las condiciones fisicoquímicas de las muestras recibidas (p. ej. pH, mineralogía, composición química, entre otros), dan cuenta de los procesos de acidificación que podrían estar tomando lugar en las aguas del tajo Anama. Vale decir que, las muestras de AC analizadas en el presente trabajo, provienen del sistema de recolección de aguas del tajo, las cuales convergen a dos estanques o pozas construidas en la parte baja del sistema, como se muestra en los puntos rojos de la Figura 1. 

Estas muestras revelaron la presencia de microorganismos acidófilos responsables de procesos de oxidación de sulfuros metálicos, los cuales trabajan consorciados para catalizar la oxidación de piritas y otros minerales que contienen azufre reducido, lo cual genera, en consecuencia, ácido sulfúrico, el cual al diluirse en el agua produce acidez y solubilización de los metales pesados presentes en las rocas circundantes (Mendez-Garcia et al., 2015). Así las cosas, como puede apreciarse en la parte inferior izquierda de la imagen satelital mostrada en la Figura 1, el punto al cual finalmente convergen estas aguas se observa alterado por fenómenos de oxidación, causados típicamente por el discurrir de aguas ácidas de origen minero. La Tabla 8, la cual resume los bioindicadores identificados en este estudio, demuestra que tanto en los “suelos contaminados”, es decir, muestras sólidas directamente tomadas del tajo Anama, como en sus “aguas contaminadas” asociadas, existe la presencia de bacterias de los géneros Acidithiobacillus, directamente responsable de la oxidación de la pirita y Metallibacterium, género de gran adaptabilidad a sistemas mineros y responsable de la formación de biopelículas que facilitan la colonización de rocas descubiertas ricas en sulfuros (Haferburg et al., 2022). Ambos tipos de microorganismos podrían catalizar la oxidación de las paredes del tajo una vez agotada la mina e incrementar la generación de aguas ácidas. En la Figura 11 se aprecia gráficamente la presencia significativa de estos dos géneros en suelos y aguas contaminadas del tajo Anama. Cabe destacar que el resto de los géneros bacterianos identificados como bioindicadores de los sitios contaminados no han sido reportados en ambientes mineros con anterioridad, de modo que su papel en estos ecosistemas poco estudiados aún se desconoce. Otros géneros bacterianos identificados no fueron señalados como bioindicadores tras el análisis estadístico, sin embargo, se conoce que juegan papeles activos en los procesos de alteración de minerales tipo sulfuro (Mendez-Garcia et al., 2015), es el caso de los géneros Gallionella (oxidante de hierro) y Sulfobacillus (oxidante de azufre), ambos presentes en las “aguas contaminadas” (muestras AC).

Por su parte, la Figura 9 muestra también que existen pocos bioindicadores característicos y comunes tanto para “aguas no contaminadas” (ANC) como “suelos no contaminados” (SNC), estos son los géneros bacterianos Fusobacterium, Leuconostoc y Acidisphaera. De estas tres, la última (Acidisphaera) ha sido efectivamente encontrada de sistemas de aguas ácidas (Kadnikov et al., 2016), mientras que las otras dos, Fusobacterium y Leuconostoc, son anaerobias o anaerobias facultativas, las cuales participan activamente en procesos fermentativos relacionados con el ciclo del ácido láctico (Ouamba et al., 2022), y son típicas del rumen e intestinos del ganado (vacunos, ovejas, caballos, etc.). Estas últimas características coinciden con el hecho de que la toma de muestras de suelos y aguas “no contaminados”, se ejecutó en una zona que, aguas arriba, muestra evidencia de actividad pecuaria, ya que se identifican corrales de una estancia ganadera, como se verifica en la Figura 1.

La técnica de la metagenómica no se queda allí, pues como se muestra en la serie de Figuras 3 a la 8, la abundancia relativa de microorganismos en cada muestra puede conocerse con precisión, desde el nivel de filo hasta los niveles de género y especie. Se puede pensar en estos resultados como una “radiografía” que revela la mayor parte de los protagonistas del microecosistema de las muestras. Esto abre las puertas a lo que se conoce como bioprospección, es decir, la identificación de microambientes dentro de la propia mina que puedan servir de “donantes” de microbios con funcionalidades interesantes para llevar a cabo procedimientos de biorremediación (Romero et al., 2021). Los procedimientos de remediación llevados a cabo de esta forma se consideran de bajo impacto ambiental, al involucrar especies propias del lugar; haciendo innecesario traer o comprar inóculos microbianos comerciales para dichas labores. No obstante, conviene aclarar que estos procesos de bioprospección deben realizarse en un número elevado de sitios de la mina y de sus zonas aledañas no afectadas por el proceso minero, con el fin de aumentar las posibilidades de encontrar microorganismos útiles. En el caso de este estudio piloto, solamente se analizaron cuatro puntos de muestreo y un total de trece muestras.

Si bien existen muchas maneras de ejecutar operaciones de biorremediación de aguas ácidas o de evitar su generación, la mayor parte de estas actividades se realizan sin un conocimiento certero de los microorganismos disponibles en el sistema. En el caso particular del presente estudio, se identificaron multitud de géneros bacterianos heterótrofos, capaces de funcionar en anaerobiosis o microaerofilia (Anoxybacillus, Clostridium, Turicibacter, Fusobacterium, Corynebacterium, Prevotella, entre otras), las cuales podrían consorciarse con otros géneros, también identificados en las muestras, que son capaces de fermentar nutrientes orgánicos en dichas condiciones ambientales (Lactobacillus, Leuconostoc, etc.) y que son capaces reducir sulfatos a sulfuros (Desulfosporosinus). Con esta combinación de microorganismos cabe la posibilidad de pensar en el diseño de sistemas de tratamiento de aguas en sistemas anaerobios (Anekwe & Isa, 2023), para facilitar la precipitación de los metales pesados y evitar la contaminación del agua; por ejemplo humedales artificiales o sistemas de tecnosuelos, totalmente adaptados a la microbiología del lugar.

Conclusiones

1. El presente estudio piloto demostró la potencialidad de los análisis metagenómicos fundamentados en la extracción de ADN ambiental en muestras provenientes de un entorno minero real, para establecer la biodiversidad de estos entornos, diagnosticar la tendencia a la generación de impactos ambientales negativos (p. ej. aguas ácidas), establecer biomarcadores entre sitios afectados y no afectados por la actividad minera y, finalmente, realizar bioprospección de cara al diseño de soluciones ecológicas para los problemas ambientales que deben encararse al momento del cierre de operaciones de minería. 

2. Se requiere, no obstante, profundizar este estudio incrementando el número de muestras y estableciendo comparaciones con los parámetros fisicoquímicos del sitio muestreado, aspecto clave para describir al detalle los ecosistemas analizados y que no fueron abordados en el presente análisis. 

3. Investigaciones con estas características resultan clave para que las empresas mineras estén en capacidad de establecer tecnologías y sistemas de manejo ambiental más sustentables, con los cuales pueda acompañar de manera eficiente sus procesos de cierre de mina. De la misma forma, se recomienda el uso de esta metodología de muestreo ambiental para enriquecer estudios de impacto ambiental, de manera que pueda compararse en forma mucho más efectiva la presencia o ausencia de microorganismos oxidantes de azufre y hierro en zonas mineras que permanezcan aún sin explotar, con el fin de establecer su posible comportamiento futuro una vez que se inicie la explotación minera y ayudar a prevenir problemas ambientales en los proyectos mineros venideros.

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