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LA METAGENÓMICA COMO TÉCNICA NOVEDOSA PARA EL ANÁLISIS DE IMPACTOS AMBIENTALES POR EFLUENTES Y EL SEGUIMIENTO EN EL TIEMPO DE L

Por: Fernando Sancho, Virginia Sebastián, Carlos Garrido-Allepuz, José María Lezcano, Ángela Acosta y Marcos Garayar, de Helix BioS y Pedro Delvasto, de la Universidad Industrial de Santander (España).


Resumen

Los residuos sólidos mineros pueden contener piritas y otros sulfuros, los cuales son inestables en presencia de aire, agua y microorganismos, dando lugar a la generación de drenajes ácidos de mina (DAM). En los procesos de rehabilitación, lo común es adoptar enfoques eminentemente fisicoquímicos, a pesar de que se conoce que los aspectos microbiológicos son relevantes, ya que catalizan la alteración de minerales sulfurosos, acelerando así la contaminación en zonas intervenidas por la minería.  

En estos escenarios, la interacción de los microorganismos (p. ej. bacterias, hongos y microalgas) con los pasivos ambientales mineros debe analizarse con un mayor nivel de profundidad, puesto que su papel es fundamental en la recuperación de los suelos y aguas. Gracias a la metagenómica, estas comunidades pueden ser estudiadas y analizadas a partir de sus rastros genéticos, lo que permite un seguimiento de las poblaciones de un ecosistema, tanto en determinados momentos y áreas, así como a lo largo de todo el proceso. Estos datos de poblaciones son usados tanto como marcadores para el control como para establecer la buena marcha del plan de rehabilitación del terreno o de las acciones de mitigación ambiental. 

En el presente trabajo, se emplearon datos genéticos de muestras ambientales, disponibles en el repositorio del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) para reevaluar las muestras y llevar a cabo estudios bioinformáticos y bioestadísticos, con métodos y procedimientos propios, con el fin de establecer la diversidad microbiana en sitios afectados por procesos de minería. 

Se eligieron dos grupos de datos, provenientes de lugares mineros con problemáticas comunes a nivel global. El primero correspondía al seguimiento de la contaminación en un sistema de mitigación de aguas ácidas de una mina de cobre en China y su descarga posterior en un río. El segundo grupo correspondió a sitios de minería de carbón en Sudáfrica, cuyos suelos fueron rehabilitados en diferentes momentos durante 24 años. 

Se pretende así mostrar un nuevo enfoque, desde la genómica computacional, que permita conocer mejor cómo son los ecosistemas afectados por la actividad minera y cómo esta información puede permitir afinar la toma de decisiones al momento de seleccionar o hacer seguimientos a sistemas de control ambiental o procesos de cierre o rehabilitación de espacios mineros.

Introducción

La rehabilitación de los espacios en los cuales se llevaron a cabo actividades mineras es una labor prioritaria y de obligatoriedad legal para los proyectos mineros actuales y futuros. El reto de la minería moderna consiste en mantener un equilibrio entre sus operaciones y el medio ambiente. El manejo adecuado de los residuos mineros, como los llamados drenajes ácidos de minería (DAM), provenientes, entre otros, de los relaves (sólidos ricos en piritas y en otros sulfuros residuales), es el factor clave para lograrlo. 

Estos residuos son efluentes con pH ácido, resultado de la reacción de la oxidación de la pirita y la generación de acidez (Dos Santos et al., 2016). Los DAM presentan, además, elevada concentración en metales, entre los que destacan el hierro, aluminio, manganeso, cobre, zinc, plomo y algunos otros metales pesados y metaloides (Park et al., 2019). Por tanto, su vertido descontrolado en aguas y suelos genera impactos muy negativos sobre la salud de las comunidades biológicas cercanas, la pérdida de biodiversidad y la destrucción de ecosistemas acuáticos (Rodríguez-Galán et al., 2019).

Según las diferentes normativas, una vez terminada la actividad minera, es necesaria la correcta clausura de la explotación y la rehabilitación, tanto de los espacios de explotación, como de los circundantes. Por lo general, este proceso se lleva a cabo mediante actuaciones simples, desde crear una barrera sobre los depósitos con otros desechos oxidados, estériles o material nativo, hasta complejos recubrimientos impermeables de múltiples barreras, con el fin de evitar la generación de acidez y la infiltración del agua hacia los depósitos (ITGME, 1989). Sin embargo, los aspectos microbiológicos que favorecen la alteración de minerales sulfurosos, hecho conocido desde las décadas de 1940 y 1950 (Ehrlich, 1999; Johnson, 2010), es un proceso mucho menos utilizado para paliar los posibles efectos negativos de estos residuos mineros.

Por otro lado, se ha comprobado que las comunidades microbianas tienen multitud de aplicaciones biotecnológicas (producción de antibióticos y otros compuestos antimicrobianos, sustancias de interés para la industria papelera o los detergentes, Prieto-Barajas et al., 2018), siendo la biorremediación una de las de más éxito en la actualidad. 

Entre los usos más destacados están la recuperación de ambientes con altas concentraciones de metales como el uranio (recuperando matrices contaminadas, Prieto­Barajas et al., 2018); ambientes contaminados por petróleo, pesticidas e insecticidas, o incluso en aguas residuales (Bender y Phillips, 2004; Bender et al., 2000; Bhatt et al., 2021; Cohen, 2002; Geetha y Fulekar, 2016; Jariyal et al., 2018; Zamora-Castro et al., 2007). Por todo ello, la utilización de estos sistemas en los procesos de biorremediación se considera una alternativa práctica, barata (en comparación con otros sistemas físicos o químicos) y respetuosa con el medio ambiente al tratarse de un proceso natural (Zamora-Castro et al., 2007).

Gracias al rápido avance de las técnicas de secuenciación metagenómica y metatranscriptómica, en la actualidad es posible la identificación más eficaz de todas las poblaciones microbianas presentes en una muestra ambiental (Handelsman, 2004; Harwani, 2012), así como estudiar qué genes se están expresando (Filiatrault, 2011), respectivamente. Ambas técnicas tienen una considerable sinergia (Epelde, 2015), permitiendo así obtener una visión más holística de todo el proceso microbiano que está ocurriendo. 

Por todo ello, esta herramienta ha sido ampliamente usada en estudios ambientales durante los últimos años, incluyendo análisis centrados en la investigación de la contaminación, así como en trabajos en fitorremediación (Yergeau, 2018; Bell, 2014), si bien su aplicación en ambientes mineros es todavía anecdótica (Epelde, 2015).

El estudio de sistemas complejos como las comunidades microbianas, presentes también en un residuo minero rehabilitado o un suelo intervenido, requiere entender aquellas relaciones que se dan entre todas las variables físicas, químicas y biológicas, más aún si se busca lograr un buen control de ciertos procesos de interés, como son los de biorremediación (Fierer, 2017; Jansson & Hofmockel, 2018). 

El uso de herramientas como el Big Data y la Inteligencia Artificial (Machine Learning) sobre los abundantes datos provenientes de las técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS), junto con un buen plan de muestreo periódico, están permitiendo obtener modelos matemáticos y trazar redes complejas de interdependencia entre las poblaciones microbianas y las variables fisicoquímicas dentro de un sistema de biorremediación (Durán et al., 2018). Este es un primer paso para crear herramientas alternativas a las técnicas actuales conducentes a la remediación efectiva y duradera de ambientes contaminados por residuos mineros altamente tóxicos, que sea, además, barata, controlable y respetuosa con el medio ambiente.

En vista de la realidad anterior, el presente trabajo tiene por objeto presentar la aplicación de la metagenómica para el monitoreo de sistemas de mitigación de impactos de los efluentes de minas y en procesos de rehabilitación de suelos afectados por minería, analizando las implicaciones de estos resultados para establecer los cambios en las poblaciones microbiológicas de entornos mineros sobre los cuales se han realizado acciones de remediación ambiental. 

A tales fines, se emplearon datos genéticos provenientes de muestras ambientales tomadas de dos sitios mineros en China y Sudáfrica, respectivamente, previamente reportados en sendas publicaciones (Qiusheng et al., 2021) y (Ezeokoli et al., 2020). Los datos, disponibles en el repositorio del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) se evaluaron empleando procedimientos bioinformáticos propios (pipelines) y métodos bioestadísticos específicos, con el fin de establecer la diversidad microbiana en estos sitios afectados por procesos de minería. 

Se eligieron dos grupos de datos, provenientes de lugares mineros con problemáticas comunes a nivel global. El primero correspondía al seguimiento de la contaminación en un sistema de mitigación de aguas ácidas de una mina de cobre en China y su descarga posterior en un río (Qiusheng et al., 2021). El segundo grupo correspondió a sitios de minería de carbón en Sudáfrica, cuyos suelos fueron rehabilitados en diferentes momentos durante 24 años (Ezeokoli et al., 2020). 

Se logró así establecer si los cambios analizados sobre las poblaciones microbianas aportan información relevante acerca de la acción de remediación, determinando si esta transcurre en la dirección correcta o no. De esta forma, se genera nuevo conocimiento en la industria y se demuestra el impacto positivo de la aplicación de esta tecnología para apoyar la restauración de ecosistemas, por ejemplo, en procesos de control ambiental de drenajes ácidos y sus consecuencias sobre el suelo o en operaciones de reforestación de sitios afectados, luego de que la explotación minera ha cesado operaciones.

Materiales y métodos

Descripción de las zonas mineras objeto de análisis

El primer estudio ejemplo (E1) (Qiusheng et al., 2021), está referido a una mina de cobre en China y trata sobre los efectos causados por un sistema de tratamiento alcalino pasivo de los drenajes ácidos de dicha unidad de cobre, con 20 años de operación, la cual vierte efluentes alcalinizados sobre el río Jinsha, en la provincia de Yunnan, en el suroeste chino (26°17.51'–26°17.59' N, 102°22.94'–102°23.17' E). 

El problema causado por el vertido de las aguas residuales de la mina al río es un incremento en la concentración de azufre (S, 84.06 g/kg), cobre (Cu, 1.63 g/kg) y otros elementos metálicos (Zn, Cr), aumentando la alcalinidad del río. En dicho estudio se recogieron un total de 36 muestras en cuatro zonas diferentes: en la poza de sedimentación (poza contaminada), en el canal efluente a la poza (canal contaminado) y aguas río arriba (antes de la poza y no contaminadas) y aguas río abajo (después de la poza y contaminadas) durante mayo de 2017. Las especificaciones y características geoquímicas de estas muestras pueden consultarse en el artículo referido (Qiusheng et al., 2021).

El segundo estudio ejemplo (E2) (Ezeokoli et al., 2020), trata sobre el cierre de minas de carbón en Sudáfrica. Este compara las poblaciones bacterianas del terreno rehabilitado de tres minas (“reclamation sites”), con respecto a las zonas de las tierras vírgenes adyacentes a cada una de ellas (“reference sites”), además de tener en cuenta que cada una de estas minas fueron rehabilitadas (reclamadas) en diferentes momentos en el tiempo. 

Las tres minas se sitúan en la provincia sudafricana de Mpumalanga (29° 3' 36'' S, 25° 52' 12'' E) y fueron denominadas como X, Y y Z. En dicho estudio, se muestrearon seis localizaciones durante los meses de abril-mayo de 2016, recogiendo un total de 66 muestras. Las especificaciones y características geoquímicas de estas pueden consultarse en el artículo referido (Ezeokoli, 2020).

Fuente de datos metagenómicos

Los datos metagenómicos han sido obtenidos del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA, European Nucleotide Archive) (Rasko, 2011). Los datos ómicos concernientes a la mina China (E1) están disponibles en el ID de estudio PRJNA544886. Son un total de 36 muestras secuenciadas mediante la tecnología de Illumina Hi-seq paired-end para el amplicón 16S (V4), con una media de 64,523 (desviación estándar: ± 13,632) lecturas crudas por muestra. Las especificaciones de la secuenciación se pueden consultar en el artículo de Qiusheng de 2021. 

Los datos concernientes a las minas sudafricanas (E2) están disponibles en el estudio PRJNA526293. Son un total de 88 muestras secuenciadas mediante la tecnología de Illumina Miseq paired-end para el amplicón 16S (V3-V4), con una media de 98,802 (± 123,154) lecturas crudas por muestra. Las especificaciones de la secuenciación se pueden consultar en el artículo de Ezeokoli de 2020. 

Análisis bioinformático de amplicones

A partir de los datos crudos de secuenciación del amplicón 16S, se realizó el procesamiento bioinformático, por separado, para cada uno de ellos, efectuando antes un control de calidad de las secuencias mediante FastQC (Andrews, 2010), realizando los sumarios con MultiQC (Ewels et al., 2016). Para eliminar las secuencias y regiones de baja calidad, se usó el programa Fastp (Chen et al. 2018). A continuación, se ejecutó el análisis de las secuencias depuradas mediante la suite Usearch v11.1 (Edgar, 2010). 

A partir de las secuencias totales se procedió a su agrupación o clusterización con el objetivo de determinar qué ZOTUs, zero-radius Operative Taxonomical Units (Callahan, 2017; Edgar, 2018) estaban presentes en las muestras. Para ello, se determinaron secuencias únicas que representan a los ZOTUs y se ordenaron según su abundancia total. Seguidamente, se eliminaron las secuencias “singletons” (aquellas que solo presentan una copia en el total de las secuencias), las secuencias quimeras y posibles secuencias artefactos, mediante el algoritmo UCHIME (Edgar et al., 2011; Edgar, 2016-1) 

Posteriormente, una vez se obtuvieron las secuencias “no quiméricas” (non-chimeric sequences), se realizó la clusterización de ZOTUs empleando el algoritmo USEARCH-UNOISE3 (Edgar, 2016-2, Edgar, 2018) a un 99% de identidad para la generación de clústeres de secuencias, teniendo como objetivo la reconstrucción de secuencias biológicas exactas. 

Finalmente, se crearon las tablas de ZOTUs. La taxonomía fue asignada mediante el algoritmo usearch-local y sintax de Usearch v11.1 (Edgar, 2011, Edgar, 2016-3) usando una base de datos de bacterias de suelos de construcción propia y una de carácter generalista, GreenGenes para 16S. 

Análisis de la microbiota

Filtrado inespecífico de las lecturas

Para ambos estudios y antes de comenzar el análisis, se realizaron dos pasos de depuración de datos. En el primero se trató de excluir aquellos ZOTUs cuyas secuencias pertenecían a cloroplastos, mitocondrias y aquellos taxones que a nivel de reino era desconocida su taxonomía (es decir, taxones no informativos), para mantener aquellas secuencias genuinamente procariotas. El segundo paso consistió en filtrar de forma inespecífica todos aquellos ZOTUs que tuvieran menos de 10 secuencias totales para el conjunto de las muestras por cada proyecto. A partir de la tabla de ZOTUs filtrada se realizaron los análisis posteriores.

Métricas de secuenciación, clusterización e identificación taxonómica

Después de los pasos de filtrado, se determinó por muestra, el número de lecturas efectivas, el número de ZOTUs, y el índice de Good’s coverage (Good, 1953; Claesson et al., 2009).

Este último es un estimador de la capacidad de la secuenciación en capturar la variabilidad biológica de las muestras. Junto con estas métricas de calidad, se determinó el grado de asignación taxonómica para cada nivel a partir de las proporciones de secuencias taxonómicamente informativas para conocer el alcance de la identificación.

Análisis de la composición microbiológica de las muestras 

Se estimaron para ambos estudios la abundancia observada, tanto absoluta como relativa, de los diferentes taxones en cada muestra, se pudo determinar la composición microbiológica de las zonas muestras en ambos estudios. 

La abundancia observada absoluta (frecuencia) se calculó teniendo en cuenta el recuento de las lecturas por cada taxón detectado a los diferentes niveles taxonómicos evaluados. 

La abundancia observada relativa (proporción) se obtuvo estimando las porcentajes de cada taxón, esto es, dividendo el recuento obtenido por cada taxón por muestra por el recuento total de lecturas en dicha muestra, este tipo de escalado también es conocido como Total-Sum Scaling (TSS). 

Para el cómputo total de lecturas por muestra, se excluyeron de su cálculo aquellos taxones sin taxonomía informativa, esto es, las proporciones estimadas fueron las válidas. La abundancia observada relativa por muestra se representó mediante gráficos de barras apiladas, siendo cada barra una muestra para filum, familia y género. Para mejorar su comprensión, además se creó una categoría formada por todos aquellos taxones que de manera global su proporción fue inferior al 1% (“Otros <1%”). 

Análisis de la biodiversidad

La biodiversidad es una propiedad emergente de las comunidades biológicas que relaciona el concepto de riqueza y diversidad. Esta relación fue estimada mediante el cálculo de los siguientes índices ecológicos de diversidad: riqueza (S), el índice de Shannon-Winner (H) y el índice Simpson (1-D). Estos se estimaron a partir de la abundancia de los ZOTUs, tomándolos como proxy de las especies halladas en estas comunidades biológicas. 

La riqueza fue definida como el número de total de ZOTUs observados por muestra. El índice de Shannon-Wiener (H) se relaciona con la diversidad e indica qué tan equitativas están representadas las especies en la comunidad. Por último, el índice de Simpson (1-D), la recíproca del índice de dominancia de Simpson (D), también se trata de un índice de diversidad (Daly et al., 2018; Fedor & Zvaríková, 2019; Simpson, 1949). 

Mediante el índice de Bray-Curtis (Bray & Curtis, 1957), se evaluó la biodiversidad entre grupos de muestras, definidos estos por los factores ambientales a estudio a partir de la matriz de abundancia estimada por ZOTU, calculando las distancias en disimilitud entre las muestras basadas. Bray-Curtis no tiene en cuenta los casos en los que la especie está ausente en los dos grupos de comparación, y está dominado por las especies abundantes, por lo que las especies raras añaden muy poco al valor del coeficiente. 

El contraste de hipótesis en cada estudio se evaluó mediante la prueba Permanova (Adonis) o Permutational Multivariate Analysis of Variance Using Distance Matrices (Anderson, 2001). Se trata de una técnica multivariante basada en un Anova con permutaciones, trabajando a partir de la matriz de distancia de Bray-Curtis y aplicando 999 permutaciones. 

Posteriormente, si ese fuese el caso, se aplicaron correcciones por comparaciones múltiples basadas en el FDR, admitiendo una tasa de error máxima del 5%. Una vez obtenidas estas matrices se aplicaron métodos de ordenamiento para la visualización de los datos, en concreto, el NMDS o ajuste no-métrico multidimensional (Non-Metric Multidimensional Scaling) (Kruskal, 1964).

Programas estadísticos

Para el tratamiento, depuración y estimación de la métricas de calidad, los índices de diversidad alfa y beta, así como la representación de la abundancia observada a los diferentes niveles taxonómicos, se utilizó el software estadístico R (R Core Team, 2019) y los paquetes estadísticos Vegan (Dixon, 2003) y Phyloseq (McMurdie & Holmes, 2013).

Resultados y análisis

A diferencia de los artículos originales (Qiusheng et al., 2021 y Ezeokoli et al., 2020) en el que se describe que la unidad de trabajo taxonómica fue el OTU (Operational Taxonomic Unit), cuyo punto de corte se establece en 97% de similitud, en estos reanálisis, en cambio, se utilizó el ZOTUs (Zero-radius Operational Taxonomic Unit), cuyo punto de corte se establece en 99% de similitud, corrigiendo los errores de secuenciación mediante diferentes enfoques de eliminación de ruido o denoising, siendo estas unidades taxonómicas más precisas que las originales para determinar la composición microbiana de las muestras basadas en el amplicón 16S. 

Análisis de la microbiota de los efluentes tratados de una mina de cobre sobre el río Jinsha (China)

Para el ejemplo E1, se obtuvieron 1’756,938 lecturas totales para el conjunto de las 36 muestras secuenciadas y un total de 1,310 ZOTUs identificados una vez filtradas las secuencias, siendo el número de medio de ZOTUs por muestra de 754 (± 203) unidades taxonómicas. El índice de Good Coverage fue del 99.6%, confirmando una buena secuenciación de las muestras. 

El porcentaje de identificación taxonómica alcanzado a nivel de género fue del 81.1%, es decir, se consiguió poner una etiqueta taxonómica mediante nuestro pipeline más del 80% de los ZOTUs a nivel de género, permitiendo tener una muy buena caracterización de la composición microbiológica de las comunidades detectadas en estas muestras de drenaje alcalinizado, proveniente de una mina de cobre en China. 

En las Figuras 1 a la 3, se visualizan los resultados de la composición microbiana de las 36 muestras a estudio, con respecto a filum, familia y género. Para mejorar su comprensión, se creó una categoría que recogió a todos aquellos taxones cuya proporción global fuese inferior al 1% además de excluir en la estimación de la abundancia relativa a aquellos taxones sin taxonomía informativa. Se observa que las muestras provenientes de las zonas no contaminadas (aguas arriba del río, en el artículo original identificadas con NR) presentaron una composición microbiológica diferente al resto de muestras. 

Los análisis de abundancia taxonómica determinó que el 99.6% de los ZOTUs detectados de media en el total de las muestras fueron clasificados como bacterianos y solo un 0.3% como arqueas. Un total de 26 filos distintos fueron detectados, destacando el filo Proteobacteria con una proporción media del 54.5%, seguido de Firmicutes (31.5%), Bacteroidetes (5.1%) y Actinobacteria (3.2%). 

Los géneros más abundantes de los 80 detectados fueron: exiguobacterium (34.7%), acinetobacter (18.5%), citrobacter (11.7%) de media para el conjunto total de las muestras; el segundo y tercer género también fueron reportados por el artículo de Qiusheng (2021). Asimismo, el género thiobacillus en las muestras contaminadas fue detectado con un 4.8% de abundancia media y en las muestras sin contaminar se obtuvo una abundancia media del 1.4%. 

Otros géneros interesantes que aparecen tanto en el artículo original como en este reanálisis fueron el género thiovirga, que en el estudio original se asoció a las muestras contaminadas, en este reanálisis, también apareció este género en abundancia en las muestras contaminadas, más concretamente, en las pertenecientes al canal de la poza, así como aguas abajo del río (5.3% y 7.4% de abundancia media, respectivamente) frente al grupo de muestras no contaminadas (aguas arriba del río) con menos del 0.3%. 

Otro género asociado a la condición de contaminación fue symbiobacterium, sin embargo, en nuestro reanálisis apenas fue detectado en las muestras obteniendo una abundancia media menor del 0.1%. 

En cuanto a la condición de “no contaminación” se corroboró la presencia del género chryseobacterium también en nuestro reanálisis (1.3%), la presencia del género GOUTA19 (orden Nitrospirales) (0.5%), la presencia del género nitrososphaera (0.3%) y planctomyces (0.3%), sin embargo, como ocurre con el anterior género, también se han identificado en muy baja abundancia. 

En nuestro reanálisis, destacaron los géneros burkholderia y flavisolibacter respecto a su abundancia en relación con los sitios no contaminados (3.6% y 5.2%, respectivamente), el género hydrogenophaga relacionado con los sitios contaminados (4.6%) y el género sulfurospirillum que destacó en las muestras de la poza (3.2%). 

En cuanto a la diversidad, se observó una mayor riqueza en las muestras no contaminadas respecto a las contaminadas, corroborando lo manifestado en el artículo original (Qiusheng et al., 2021). En la Tabla 1, se describen las estimaciones medias de los índices de alfa-diversidad calculados en este reanálisis: riqueza (S), índice de Shannon-Weiner (H) y el índice de Simpson (1-D). Se advierte que las muestras no contaminadas presentaron una mayor riqueza como diversidad respecto al resto, mientras que las muestras de la poza fueron las que menor riqueza y diversidad obtuvieron.

Comparando las poblaciones bacterianas de las muestras de zonas contaminadas y las aguas río arriba, se encontraron diferencias significativas (p < 0.001, Permanova). Esto se puede visualizar en la Figura 4, que agrupa las muestras según la similitud de sus poblaciones y, claramente, se observa que las muestras contaminadas se diferencian de las no contaminadas.

No solo se puede diferenciar entre el agua contaminada y la limpia, sino que además, se pudo hallar diferencias estadísticamente significativas (p < 0.020, Permanova) entre el grupo compuesto por el agua de la poza alcalina y el canal que la vierte al río, y el agua del río cauce debajo de la mina corrigiendo por comparaciones múltiples. 

Esto es fácilmente explicable, ya que el caudal no contaminado del río se mezcla con el agua contaminada, diluyéndola. Sin embargo, queda claro que la población bacteriana del agua cauce debajo de la mina es más similar al agua de la poza alcalina que a la del caudal no contaminado del río.

Análisis de la microbiota de las minas de carbón de Mpumalanga (Sudáfrica)

Se obtuvieron 1’422,360 lecturas totales para el conjunto de las 66 muestras secuenciadas y un total de 4,961 ZOTUs identificados una vez filtradas las secuencias, siendo el número de medio de ZOTUs por muestra de 1,489 (± 656) unidades taxonómicas. El índice de Good Coverage fue del 94.6%, confirmando una buena secuenciación de las muestras de manera global. Sin embargo, en cuanto a la identificación taxonómica tuvo peor rendimiento a diferencia del estudio previo, ya que solo se consiguió identificar a nivel de género el 17.5% de los ZOTUs. 

Prácticamente, el total de los ZOTUs detectados en las muestras corresponden a la clasificación de bacteria. Los filos más abundantes de media fueron Actinobacteria (32.5%), Proteobacteria (16.9%), Planctomycetes (16.3%) y Chloroflexi (14.0%). Estos filos también fueron detectados en el artículo original. En cuanto a los géneros más abundantes de media en el conjunto de los datos fueron sphingomonas (13.1%), bradyrhizobium (8%), el género DA101 (filo Verrucomicrobia) (7.8%) y mycobacterium (7.3%). Destacando el género sphingomonas relacionado con la recircularización de los elementos químicos esenciales en los suelos agrícolas. En las Figuras 5 a la 7 se muestran los resultados con respecto a filum, familia y género de este análisis, agrupando las muestras por periodos de años.

Las tres minas fueron reclamadas en periodos diferentes, lo que permitió encontrar una relación entre el tiempo transcurrido desde que la tierra fue reclamada y la diversidad bacteriana del terreno. Si bien, en cuanto riqueza, los sitios reclamados tuvieron una mayor riqueza media de especies respecto a las zonas naturales, se halló una tendencia al alza de la riqueza entre los sitios reclamados en correlación con el aumento del periodo transcurrido de la reclamación de la mina, es decir, se observó un aumento de la riqueza a medida que aumentaba el periodo de reclamación (Tabla 2). 

Esta misma tendencia se puede observar en los índices de diversidad Shannon y Simpson, de manera que a medida que aumentó el periodo de reclamación, se incrementó la diversidad en las muestras.

Los resultados del análisis realizado indican que hay una relación positiva entre la diversidad del terreno y el tiempo transcurrido desde que empezó su rehabilitación. Las métricas de diversidad riqueza, según Shannon y Simpson, reflejan una tendencia logarítmica, es decir, la diversidad del terreno crece rápido los primeros 10 años desde la rehabilitación del terreno, y más adelante continúa aumentando a menor ritmo según esta diversidad se estabiliza a un nivel sano (Figura 8).

Comentarios finales

El análisis metagenómico permite establecer cómo es la diversidad de los microorganismos en ambientes afectados por la actividad minera y su comparación con ecosistemas no afectados o sometidos a procesos de remediación o rehabilitación. Los dos ejemplos analizados en el presente trabajo dan cuenta de ello, para dos aspectos muy comunes desde la perspectiva ambiental del negocio minero, como lo son el tratamiento de aguas de mina y la rehabilitación de suelos.

El primer análisis realizado (E1), sobre muestras tomadas en diferentes lugares relacionados con un sistema de tratamiento de aguas de mina (Qiusheng et al., 2021), mostró como la descarga del efluente tratado en un río afectaba la diversidad microbiológica, tanto dentro del propio sistema de tratamiento como aguas arriba como aguas abajo del punto de vertimiento. A pesar de tratarse de un sistema muy común de tratamiento pasivo de aguas ácidas (pozas de sedimentación alcalinas), se apreciaron diferencias estadísticamente significativas al comparar con los puntos aguas arriba del lugar de vertimiento. 

Entre la población bacteriana de las aguas contaminadas se encuentran varios taxones que actúan como indicadores de los desechos metálicos y de azufre en el agua, como son bacterias de los géneros thiovirga y thiobacillus, las cuales están involucradas en la oxidación del azufre; y symbiobacterium y alishewanella, las cuales son muy resistentes a las altas concentraciones de elementos metálicos como el cobre y el manganeso. Esto indica que la población microbiológica de un ecosistema es un fiel marcador de su salud, y los cambios producidos por esta mina de cobre muestran su gran efecto en el río, a pesar de que su caudal sea mucho mayor que el agua contaminada vertida en él.

Por su parte, en el segundo análisis (E2), se observan las diferencias en términos de diversidad microbiana de suelos rehabilitados en minas de carbón cerradas, a lo largo de un período de 24 años en Sudáfrica (Ezeokoli et al., 2020). Los resultados encontrados en este caso resultan muy interesantes, ya que más allá de recuperarse la diversidad bacteriana de la tierra, la mayoría de las muestras de más de 15 años superan la diversidad media de las muestras de tierras vírgenes cercanas a las zonas de actividad minera. 

Esto puede deberse a múltiples factores, entre ellos el hecho de que las operaciones de rehabilitación en dichos sitios involucraron labores de fertilización y colonización del suelo con diversas especies de gramíneas (Ezeokoli et al., 2020), lo cual acabó por producir un ecosistema más variado que el originalmente encontrado en dichos lugares, antes de la actividad minera. Esto constituye un poderoso ejemplo de cómo puede medirse cuantitativamente, de una manera muy precisa, el incremento de la capacidad de prestación de servicios ecosistémicos de los suelos de un área rehabilitada luego de la explotación minera, empleando para ello herramientas metagenómicas.

En conclusión, la metagenómica constituye una herramienta novedosa que permite visualizar de una manera efectiva cómo son los ecosistemas microbianos en un ambiente afectado por la minería y que posibilita evaluar de forma realista la salud de dichos ecosistemas y la eficacia de los procedimientos de remediación ambiental asociados con procedimientos de cierre de minas. 

Bibliografía

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