REVISTA MINERÍA 539 | EDICIÓN AGOSTO 2022

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MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 6 Ofrecer a nuestros lectores conocimiento, tecnología e innovación, orientados al desarrollo productivo y sostenible de las operaciones mineras, buscando la mejora de la calidad y competitividad del sector minero. Misión: PRESIDENTE: Abraham Chahuan 1er. VICEPRESIDENTE: Darío Zegarra 2do.VICEPRESIDENTE: Juan Carlos Ortíz DIRECTORES Raúl Garay Jimena Sologuren Johny Orihuela Julia Torreblanca Miguel Cardozo Roberto Maldonado Rómulo Mucho Alfredo Alfaro Edgardo Orderique Diana Rake Tomás Gonzáles EXPRESIDENTE: Víctor Gobitz REPRESENTANTE CIP: Germán Arce GERENTE GENERAL: Carlos Diez Canseco COMITÉ EDITORIAL: Miguel Cardozo Roberto Maldonado Richard Contreras Darío Zegarra Luz Cabrera Diógenes Uceda Rómulo Mucho PUBLICACIÓN OFICIAL DEL IIMP www.revistamineria.com.pe rmineria@iimp.org.pe 539 Agosto 2022 Director: Venancio Astucuri Subdirector: Homar Lozano Editor: Hebert Ubillús Arriola Publicidad: 961748318 / 944570038 Colaboradores: Fernando Sancho, Virginia Sebastián, Carlos Garrido-Allepuz, José María Lezcano, Ángela Acosta, Marcos Garayar y Pedro Delvasto – Ysmael Ormeño y Edison Ventura – Pedro Castellares – Ronald Ticona y Jair Alarcón – Julio Roncal y Renato Urízar – Miguel Sánchez – Augusto Ramírez Diagramación: César Blas Valdivia Corrección: C & S Comunicaciones MINERÍA es la publicación oficial del Instituto de Ingenieros de Minas del Perú Calle Los Canarios 155-157, Urb. San César - II Etapa, La Molina, Lima 12, Perú. Telf. (511) 313-4160 / E-mail: rmineria@iimp.org.pe http://www.iimp.org.pe «Hecho el Depósito Legal Nº 98-3584 en la Biblioteca Nacional del Perú» El Instituto de Ingenieros de Minas del Perú no se solidariza necesariamente con las opiniones expresadas en los artículos publicados en esta edición de MINERÍA. Se autoriza la reproducción de los textos siempre que se cite la fuente Contenido Histórico 76 Apuntes para la historia de la minería en los Andes centrales del Perú Medio Ambiente 08 La metagenómica como técnica novedosa para el análisis de impactos ambientales por efluentes y el seguimiento en el tiempo de la rehabilitación del suelo en zonas mineras desde una perspectiva microbiológica integral Plantas de Beneficio 40 Estimación del número óptimo de clústeres y valor límite para el contenido de óxido (%tox) y su impacto en la recuperación de cobre mediante el algoritmo K-Means Machine Learning 50 Impacto de la metodología Mine to Plant en una mina a tajo abierto del Perú Universidades Gestión Social Editorial 68 Desarrollo del sistema pasivo sustrato alcalino disperso para el tratamiento de drenaje ácido de mina 62 Modelo Multiactor para la Gestión Integral de COVID-19 de Hudbay Perú 07 La innovación como factor para la protección del medio ambiente 28 El cierre del depósito de desmontes Excélsior en Pasco, considerado el pasivo ambiental minero más grande del Perú y América Latina

MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 7 La innovación como factor para la protección del medio ambiente Editorial La transformación digital que es una actividad innovadora y transversal aplicada a los diferentes procesos mineros, también tiene incidencia en la protección, control y remediación del medio ambiente y, en especial, de los recursos hídricos. Es así que las principales operaciones mineras del país ya cuentan con aplicaciones para el adecuado manejo y recirculación del agua que utilizan, con el fin de minimizar su consumo y, con miras al cierre de la operación, para prevenir su futura contaminación con los desechos mineros. Esto es un paso trascendental para mantener estándares de calidad que garanticen a las poblaciones circundantes que las aguas que utilizan no son afectadas por la actividad minera y, los recursos que esta usa, son cuidadosamente administrados hasta alcanzar el vertimiento cero en los ríos o causes. Desde la década de los 90 del siglo pasado, en que se fortaleció la regulación ambiental minera, las empresas cumplen estrictos estándares que son debidamente supervisados, proceso en el que la incorporación de tecnología ha sido clave. Actualmente, compañías nacionales como Minsur, que pertenece al International Council on Mining and Metals (ICMM), que agrupa a las principales empresas mineras del mundo, trabajan en la aplicación de herramientas como el Blockchain para transparentar toda la cadena de valor del estaño. Es decir, en un futuro próximo las autoridades gubernamentales en todos sus niveles y los grupos de interés, podrán supervisar en línea y en tiempo real los controles de calidad que realiza la empresa del agua, aire y suelos, entre otras actividades. Este nivel de transparencia es fundamental en la actividad minera peruana, con el fin de confirmar y mostrar, con el apoyo de la tecnología, que efectivamente se cumplen los estándares ambientales y se protegen los ecosistemas circundantes. De esta forma, la población podrá disipar sus dudas y más allá de asistir a la presentación de los Estudios de Impacto Ambiental que exige la ley o ser parte de los monitoreos ambientales participativos que se hacen periódicamente, verificar en tiempo real que las compañías cumplen con el cuidado del ambiente. No tenemos duda que por el nivel tecnológico alcanzado a la fecha y la aplicación de rigurosos estándares, esto podrá ser una realidad no solo en una empresa sino en todo el sector, como ocurre en otros países mineros de clase mundial como el nuestro. La minería peruana ha dado grandes pasos en los últimos tiempos en materia de cuidado del medio ambiente y ello puede transparentarse aún más con el uso de las innovaciones tecnológicas vigentes, con el propósito que la población comprenda que los pasivos ambientales del pasado responden a prácticas que eran el estándar de la época, pero que en pleno siglo XXI estamos en otro momento y la actividad minera aplica nuevas herramientas para minimizar su impacto. Venancio Astucuri, director.

MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 8 La metagenómica como técnica novedosa para el análisis de impactos ambientales por efluentes y el seguimiento en el tiempo de la rehabilitación del suelo en zonas mineras desde una perspectiva microbiológica integral Medio Ambiente Por: Fernando Sancho, Virginia Sebastián, Carlos Garrido-Allepuz, José María Lezcano, Ángela Acosta y Marcos Garayar, de Helix BioS y Pedro Delvasto, de la Universidad Industrial de Santander (España). Resumen Los residuos sólidos mineros pueden contener piritas y otros sulfuros, los cuales son inestables en presencia de aire, agua y microorganismos, dando lugar a la generación de drenajes ácidos de mina (DAM). En los procesos de rehabilitación, lo común es adoptar enfoques eminentemente fisicoquímicos, a pesar de que se conoce que los aspectos microbiológicos son relevantes, ya que catalizan la alteración de minerales sulfurosos, acelerando así la contaminación en zonas intervenidas por la minería. En estos escenarios, la interacción de los microorganismos (p. ej. bacterias, hongos y microalgas) con los pasivos ambientales mineros debe analizarse con un mayor nivel de profundidad, puesto que su papel es fundamental en la recuperación de los suelos y aguas. Gracias a la metagenómica, estas comunidades pueden ser estudiadas y analizadas a partir de sus rastros genéticos, lo que permite un seguimiento de las poblaciones de un ecosistema, tanto en determinados momentos y áreas, así como a lo largo de todo el proceso. Estos datos de poblaciones son usados tanto como marcadores para el control como para establecer la buena marcha del plan de rehabilitación del terreno o de las acciones de mitigación ambiental. En el presente trabajo, se emplearon datos genéticos de muestras ambientales, disponibles en el repositorio del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) para reevaluar las muestras y llevar a cabo estudios bioinformáticos y bioestadísticos, con métodos y procedimientos propios, con el fin de establecer la diversidad microbiana en sitios afectados por procesos de minería. Se eligieron dos grupos de datos, provenientes de lugares mineros con problemáticas comunes a nivel global. El primero correspondía al seguimiento de la contaminación en un sistema de mitigación de aguas ácidas de una mina de cobre en China y su descarga posterior en un río. El segundo grupo correspondió a sitios de minería de carbón en Sudáfrica, cuyos suelos fueron rehabilitados en diferentes momentos durante 24 años. Se pretende así mostrar un nuevo enfoque, desde la genómica computacional, que permita conocer mejor cómo son los ecosistemas afectados por la actividad minera y cómo esta información puede permitir afinar la toma de decisiones al momento de seleccionar o hacer seguimientos a sistemas de control ambiental o procesos de cierre o rehabilitación de espacios mineros.

MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 9 Abstract Solid mining waste may contain pyrites and other sulfides, which are unstable in the presence of air, water and microorganisms, leading to the generation of acid mine drainage (AMD). In rehabilitation processes, it is common to adopt eminently physical-chemical approaches, despite the fact that microbiological aspects are known to be relevant, since they catalyze the alteration of sulfide minerals, thus accelerating contamination in areas affected by mining. In these scenarios, the interaction of microorganisms (e.g. bacteria, fungi and microalgae) with mining environmental liabilities must be analyzed in greater depth, since their role is fundamental in the reclamation of soils and waters. Thanks to metagenomics, these communities can be studied and analyzed from their genetic traces, which allows monitoring of the populations of an ecosystem, both at certain times and areas as well as throughout the entire process. These population data are used as markers for control to establish the proper progress of the land rehabilitation plan or environmental mitigation actions. In the present work, genetic data from environmental samples, available in the repository of the European Nucleotide Archive (ENA) were used to re-evaluate the samples and carry out bioinformatic and biostatistical studies, with our own methods and procedures, in order to establish the diversity microbial in sites affected by mining processes. Two groups of data were chosen from mining sites with common problems at a global level. The first group corresponded to the monitoring of contamination in an acid water mitigation system of a copper mine in China and its subsequent discharge into a river. The second group chosen corresponded to coal mining sites in South Africa, whose soils were rehabilitated at different times for 24 years. It is thus intended to show a new approach, from computational genomics, which allows a better understanding of how the ecosystems affected by mining activity are and how this information can allow fine-tuning decision-making when selecting or monitoring environmental control systems or processes of closure or rehabilitation of mining sites. Introducción La rehabilitación de los espacios en los cuales se llevaron a cabo actividades mineras es una labor prioritaria y de obligatoriedad legal para los proyectos mineros actuales y futuros. El reto de la minería moderna consiste en mantener un equilibrio entre sus operaciones y el medio ambiente. El manejo adecuado de los residuos mineros, como los llamados drenajes ácidos de minería (DAM), provenientes, entre otros, de los relaves (sólidos ricos en piritas y en otros sulfuros residuales), es el factor clave para lograrlo. Estos residuos son efluentes con pH ácido, resultado de la reacción de la oxidación de la pirita y la generación de acidez (Dos Santos et al., 2016). Los DAM presentan, además, elevada concentración en metales, entre los que destacan el hierro, aluminio, manganeso, cobre, zinc, plomo y algunos otros metales pesados y metaloides (Park et al., 2019). Por tanto, su vertido descontrolado en aguas y suelos genera impactos muy negativos sobre la salud de las comunidades biológicas cercanas, la pérdida de biodiversidad y la destrucción de ecosistemas acuáticos (Rodríguez-Galán et al., 2019).

MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 10 Según las diferentes normativas, una vez terminada la actividad minera, es necesaria la correcta clausura de la explotación y la rehabilitación, tanto de los espacios de explotación, como de los circundantes. Por lo general, este proceso se lleva a cabo mediante actuaciones simples, desde crear una barrera sobre los depósitos con otros desechos oxidados, estériles o material nativo, hasta complejos recubrimientos impermeables de múltiples barreras, con el fin de evitar la generación de acidez y la infiltración del agua hacia los depósitos (ITGME, 1989). Sin embargo, los aspectos microbiológicos que favorecen la alteración de minerales sulfurosos, hecho conocido desde las décadas de 1940 y 1950 (Ehrlich, 1999; Johnson, 2010), es un proceso mucho menos utilizado para paliar los posibles efectos negativos de estos residuos mineros. Por otro lado, se ha comprobado que las comunidades microbianas tienen multitud de aplicaciones biotecnológicas (producción de antibióticos y otros compuestos antimicrobianos, sustancias de interés para la industria papelera o los detergentes, Prieto-Barajas et al., 2018), siendo la biorremediación una de las de más éxito en la actualidad. Entre los usos más destacados están la recuperación de ambientes con altas concentraciones de metales como el uranio (recuperando matrices contaminadas, PrietoBarajas et al., 2018); ambientes contaminados por petróleo, pesticidas e insecticidas, o incluso en aguas residuales (Bender y Phillips, 2004; Bender et al., 2000; Bhatt et al., 2021; Cohen, 2002; Geetha y Fulekar, 2016; Jariyal et al., 2018; Zamora-Castro et al., 2007). Por todo ello, la utilización de estos sistemas en los procesos de biorremediación se considera una alternativa práctica, barata (en comparación con otros sistemas físicos o químicos) y respetuosa con el medio ambiente al tratarse de un proceso natural (Zamora-Castro et al., 2007). Figura 1. Abundancia relativa observada (%) de los filos bacterianos de muestras de sedimentos de la mina de cobre del río Jinsha (China) con drenaje alcalino. Cada barra vertical representa una muestra (N=36) y están agrupadas bajo las cuatro localizaciones descritas. Se presentan los filos más abundantes en todas las muestras y los taxones con una abundancia global inferior al 1% conforman una sola categoría nombrada como “Otros” (en gris). No se incluyen los taxones no informativos.

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MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 12 Gracias al rápido avance de las técnicas de secuenciación metagenómica y metatranscriptómica, en la actualidad es posible la identificación más eficaz de todas las poblaciones microbianas presentes en una muestra ambiental (Handelsman, 2004; Harwani, 2012), así como estudiar qué genes se están expresando (Filiatrault, 2011), respectivamente. Ambas técnicas tienen una considerable sinergia (Epelde, 2015), permitiendo así obtener una visión más holística de todo el proceso microbiano que está ocurriendo. Por todo ello, esta herramienta ha sido ampliamente usada en estudios ambientales durante los últimos años, incluyendo análisis centrados en la investigación de la contaminación, así como en trabajos en fitorremediación (Yergeau, 2018; Bell, 2014), si bien su aplicación en ambientes mineros es todavía anecdótica (Epelde, 2015). El estudio de sistemas complejos como las comunidades microbianas, presentes también en un residuo minero rehabilitado o un suelo intervenido, requiere entender aquellas relaciones que se dan entre todas las variables físicas, químicas y biológicas, más aún si se busca lograr un buen control de ciertos procesos de interés, como son los de biorremediación (Fierer, 2017; Jansson & Hofmockel, 2018). El uso de herramientas como el Big Data y la Inteligencia Artificial (Machine Learning) sobre los abundantes datos provenientes de las técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS), junto con un buen plan de muestreo periódico, están permitiendo obtener modelos matemáticos y trazar redes complejas de interdependencia entre las poblaciones microbianas y las variables fisicoquímicas dentro de un sistema de biorremediación (Durán et al., 2018). Este es un primer paso para crear herramientas alternativas a las técnicas actuales conducentes a la remediación efectiva y duradera de ambientes contaminados por residuos mineros altamente tóxicos, que sea, además, barata, controlable y respetuosa con el medio ambiente. Figura 2. Abundancia relativa observada (%) de las familias bacterianas de muestras de sedimentos de la mina de cobre del río Jinsha (China) con drenaje alcalino. Cada barra vertical representa una muestra (N=36) y están agrupadas bajo las cuatro localizaciones descritas. Se presentan las familias más abundantes en todas las muestras y los taxones con una abundancia global inferior al 1% conforman una sola categoría nombrada como “Otros” (en gris). No se incluye los taxones no informativos.

MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 13 En vista de la realidad anterior, el presente trabajo tiene por objeto presentar la aplicación de la metagenómica para el monitoreo de sistemas de mitigación de impactos de los efluentes de minas y en procesos de rehabilitación de suelos afectados por minería, analizando las implicaciones de estos resultados para establecer los cambios en las poblaciones microbiológicas de entornos mineros sobre los cuales se han realizado acciones de remediación ambiental. A tales fines, se emplearon datos genéticos provenientes de muestras ambientales tomadas de dos sitios mineros en China y Sudáfrica, respectivamente, previamente reportados en sendas publicaciones (Qiusheng et al., 2021) y (Ezeokoli et al., 2020). Los datos, disponibles en el repositorio del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) se evaluaron empleando procedimientos bioinformáticos propios (pipelines) y métodos bioestadísticos específicos, con el fin de establecer la diversidad microbiana en estos sitios afectados por procesos de minería. Se eligieron dos grupos de datos, provenientes de lugares mineros con problemáticas comunes a nivel global. El primero correspondía al seguimiento de la contaminación en un sistema de mitigación de aguas ácidas de una mina de cobre en China y su descarga posterior en un río (Qiusheng et al., 2021). El segundo grupo correspondió a sitios de minería de carbón en Sudáfrica, cuyos suelos fueron rehabilitados en diferentes momentos durante 24 años (Ezeokoli et al., 2020). Se logró así establecer si los cambios analizados sobre las poblaciones microbianas aportan información relevante acerca de la acción de remediación, determinando si esta transcurre en la dirección correcta o no. De esta forma, se genera nuevo conocimiento en la industria y se demuestra el impacto positivo de la aplicación de esta tecnología para apoyar la restauración de ecosistemas, por ejemplo, en procesos de control ambiental de drenajes ácidos y sus consecuencias sobre el suelo o en operaciones de Figura 3. Abundancia relativa observada (%) de los géneros bacterianos de muestras de sedimentos de la mina de cobre del río Jinsha (China) con drenaje alcalino. Cada barra vertical representa una muestra (N=36) y están agrupadas bajo las cuatro localizaciones descritas. Se presentan los géneros más abundantes en todas las muestras y los taxones con una abundancia global inferior al 1% conforman una sola categoría nombrada como “Otros” (en gris). No se incluye los taxones no informativos.

MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 14 reforestación de sitios afectados, luego de que la explotación minera ha cesado operaciones. Materiales y métodos Descripción de las zonas mineras objeto de análisis El primer estudio ejemplo (E1) (Qiusheng et al., 2021), está referido a una mina de cobre en China y trata sobre los efectos causados por un sistema de tratamiento alcalino pasivo de los drenajes ácidos de dicha unidad de cobre, con 20 años de operación, la cual vierte efluentes alcalinizados sobre el río Jinsha, en la provincia de Yunnan, en el suroeste chino (26°17.51'– 26°17.59' N, 102°22.94'–102°23.17' E). El problema causado por el vertido de las aguas residuales de la mina al río es un incremento en la concentración de azufre (S, 84.06 g/kg), cobre (Cu, 1.63 g/kg) y otros elementos metálicos (Zn, Cr), aumentando la alcalinidad del río. En dicho estudio se recogieron un total de 36 muestras en cuatro zonas diferentes: en la poza de sedimentación (poza contaminada), en el canal efluente a la poza (canal contaminado) y aguas río arriba (antes de la poza y no contaminadas) y aguas río abajo (después de la poza y contaminadas) durante mayo de 2017. Las especificaciones y características geoquímicas de estas muestras pueden consultarse en el artículo referido (Qiusheng et al., 2021). El segundo estudio ejemplo (E2) (Ezeokoli et al., 2020), trata sobre el cierre de minas de carbón en Sudáfrica. Este compara las poblaciones bacterianas del terreno rehabilitado de tres minas (“reclamation sites”), con respecto a las zonas de las tierras vírgenes adyacentes a cada una de ellas (“reference sites”), además de tener en cuenta que cada una de estas minas fueron rehabilitadas (reclamadas) en diferentes momentos en el tiempo. Las tres minas se sitúan en la provincia sudafricana de Mpumalanga (29° 3' 36'' S, 25° 52' 12'' E) y fueron denominadas como X, Y y Z. En dicho estudio, se muestrearon seis localizaciones durante los meses de abril-mayo de 2016, recogiendo un total de 66 muestras. Las especificaciones y características geoquímicas de estas pueden consultarse en el artículo referido (Ezeokoli, 2020). Fuente de datos metagenómicos Los datos metagenómicos han sido obtenidos del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA, European Nucleotide Archive) (Rasko, 2011). Los datos ómicos concernientes a la mina China (E1) están disponibles en el ID de estudio PRJNA544886. Son un total de 36 muestras secuenciadas mediante la tecnología de Illumina Hi-seq paired-end para el amplicón 16S (V4), con una media de 64,523 (desviación estándar: ± 13,632) lecturas crudas por muestra. Las especificaciones de la secuenciación se pueden consultar en el artículo de Qiusheng de 2021. Los datos concernientes a las minas sudafricanas (E2) están disponibles en el estudio PRJNA526293. Son un total de 88 muestras secuenciadas mediante la tecnología de Illumina Miseq paired-end para el amplicón 16S (V3V4), con una media de 98,802 (± 123,154) lecturas crudas por muestra. Las especificaciones de la secuenciación se pueden consultar en el artículo de Ezeokoli de 2020. Análisis bioinformático de amplicones A partir de los datos crudos de secuenciación del amplicón 16S, se realizó el procesamiento bioinformático, por separado, para cada uno de ellos, efectuando antes un control de calidad de las secuencias mediante FastQC (Andrews, 2010), realizando los sumarios con MultiQC (Ewels et al., 2016). Para eliminar las secuencias y regiones de baja calidad, se usó el programa Fastp (Chen et al. 2018). A continuación, se ejecutó el análisis de las secuencias depuradas mediante la suite Usearch v11.1 (Edgar, 2010). A partir de las secuencias totales se procedió a su agrupación o clusterización con el objetivo de determinar qué ZOTUs, zero-radius Operative Taxonomical Units (Callahan, 2017; Edgar,

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MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 16 2018) estaban presentes en las muestras. Para ello, se determinaron secuencias únicas que representan a los ZOTUs y se ordenaron según su abundancia total. Seguidamente, se eliminaron las secuencias “singletons” (aquellas que solo presentan una copia en el total de las secuencias), las secuencias quimeras y posibles secuencias artefactos, mediante el algoritmo UCHIME (Edgar et al., 2011; Edgar, 2016-1) Posteriormente, una vez se obtuvieron las secuencias “no quiméricas” (non-chimeric sequences), se realizó la clusterización de ZOTUs empleando el algoritmo USEARCH-UNOISE3 (Edgar, 2016-2, Edgar, 2018) a un 99% de identidad para la generación de clústeres de secuencias, teniendo como objetivo la reconstrucción de secuencias biológicas exactas. Finalmente, se crearon las tablas de ZOTUs. La taxonomía fue asignada mediante el algoritmo usearch-local y sintax de Usearch v11.1 (Edgar, 2011, Edgar, 2016-3) usando una base de datos de bacterias de suelos de construcción propia y una de carácter generalista, GreenGenes para 16S. Análisis de la microbiota Filtrado inespecífico de las lecturas Para ambos estudios y antes de comenzar el análisis, se realizaron dos pasos de depuración de datos. En el primero se trató de excluir aquellos ZOTUs cuyas secuencias pertenecían a cloroplastos, mitocondrias y aquellos taxones que a nivel de reino era desconocida su taxonomía (es decir, taxones no informativos), para mantener aquellas secuencias genuinamente procariotas. El segundo paso consistió en filtrar de forma inespecífica todos aquellos ZOTUs que tuvieran menos de 10 secuencias totales para el conjunto de las muestras por cada proyecto. A partir de la tabla de ZOTUs filtrada se realizaron los análisis posteriores. Métricas de secuenciación, clusterización e identificación taxonómica Después de los pasos de filtrado, se determinó por muestra, el número de lecturas efectivas, el número de ZOTUs, y el índice de Good’s coverage (Good, 1953; Claesson et al., 2009). Este último es un estimador de la capacidad de la secuenciación en capturar la variabilidad biológica de las muestras. Junto con estas métricas de calidad, se determinó el grado de asignación taxonómica para cada nivel a partir de las proporciones de secuencias taxonómicamente informativas para conocer el alcance de la identificación. Análisis de la composición microbiológica de las muestras Se estimaron para ambos estudios la abundancia observada, tanto absoluta como relativa, de los diferentes taxones en cada muestra, se pudo determinar la composición microbiológica de las zonas muestras en ambos estudios. La abundancia observada absoluta (frecuencia) se calculó teniendo en cuenta el recuento de las lecturas por cada taxón detectado a los diferentes niveles taxonómicos evaluados. Tabla 1. Estimaciones de los Índices de Diversidad Alfa Determinados por Localizaciones (media [± desviación estándar]) Localizaciones Contaminación S H 1-D Aguas arriba (NR) No 1,044 (± 99) 5.43 (± 0.20) 0.98 (± 0.01) Aguas abajo (DR) Sí 701 (± 153) 3.68 (± 0.77) 0.92 (± 0.03) Canal (EC) Sí 639 (± 109) 3.28 (± 0.72) 0.91 (± 0.04) Poza (SP) Sí 633 (± 84) 3.25 (± 0.67) 0.90 (± 0.04)

MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 17 La abundancia observada relativa (proporción) se obtuvo estimando las porcentajes de cada taxón, esto es, dividendo el recuento obtenido por cada taxón por muestra por el recuento total de lecturas en dicha muestra, este tipo de escalado también es conocido como Total-Sum Scaling (TSS). Para el cómputo total de lecturas por muestra, se excluyeron de su cálculo aquellos taxones sin taxonomía informativa, esto es, las proporciones estimadas fueron las válidas. La abundancia observada relativa por muestra se representó mediante gráficos de barras apiladas, siendo cada barra una muestra para filum, familia y género. Para mejorar su comprensión, además se creó una categoría formada por todos aquellos taxones que de manera global su proporción fue inferior al 1% (“Otros <1%”). Análisis de la biodiversidad La biodiversidad es una propiedad emergente de las comunidades biológicas que relaciona el concepto de riqueza y diversidad. Esta relación fue estimada mediante el cálculo de los siguientes índices ecológicos de diversidad: riqueza (S), el índice de Shannon-Winner (H) y el índice Simpson (1-D). Estos se estimaron a partir de la abundancia de los ZOTUs, tomándolos como proxy de las especies halladas en estas comunidades biológicas. La riqueza fue definida como el número de total de ZOTUs observados por muestra. El índice de Shannon-Wiener (H) se relaciona con la diversidad e indica qué tan equitativas están representadas las especies en la comunidad. Por último, el índice de Simpson (1-D), la recíproca del índice de dominancia de Simpson (D), también se trata de un índice de diversidad (Daly et al., 2018; Fedor & Zvaríková, 2019; Simpson, 1949). Mediante el índice de Bray-Curtis (Bray & Curtis, 1957), se evaluó la biodiversidad entre grupos de muestras, definidos estos por los factores ambientales a estudio a partir de la matriz de abundancia estimada por ZOTU, calculando las distancias en disimilitud entre las muestras basadas. Bray-Curtis no tiene en cuenta los casos en los que la especie está ausente en los dos grupos de comparación, y está dominado por las especies abundantes, por lo que las especies raras añaden muy poco al valor del coeficiente. El contraste de hipótesis en cada estudio se evaluó mediante la prueba Permanova (Adonis) o Permutational Multivariate Analysis of Variance Using Distance Matrices (Anderson, 2001). Se trata de una técnica multivariante basada en un Anova con permutaciones, trabajando a partir de la matriz de distancia de Bray-Curtis y aplicando 999 permutaciones. Posteriormente, si ese fuese el caso, se aplicaron correcciones por comparaciones múltiples basadas en el FDR, admitiendo una tasa de error máxima del 5%. Una vez obtenidas estas matrices se aplicaron métodos de ordenamiento para la visualización de los datos, en concreto, Figura 4. Ordenamiento NMDS de los diferentes grupos de muestras. Las de agua limpia se agrupan juntas y los tres grupos de aguas contaminadas igual, no habiendo diferencias significativas (p > 0.05, Permanova) entre estos.

MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 18 el NMDS o ajuste no-métrico multidimensional (Non-Metric Multidimensional Scaling) (Kruskal, 1964). Programas estadísticos Para el tratamiento, depuración y estimación de la métricas de calidad, los índices de diversidad alfa y beta, así como la representación de la abundancia observada a los diferentes niveles taxonómicos, se utilizó el software estadístico R (R Core Team, 2019) y los paquetes estadísticos Vegan (Dixon, 2003) y Phyloseq (McMurdie & Holmes, 2013). Resultados y análisis A diferencia de los artículos originales (Qiusheng et al., 2021 y Ezeokoli et al., 2020) en el que se describe que la unidad de trabajo taxonómica fue el OTU (Operational Taxonomic Unit), cuyo punto de corte se establece en 97% de similitud, en estos reanálisis, en cambio, se utilizó el ZOTUs (Zero-radius Operational Taxonomic Unit), cuyo punto de corte se establece en 99% de similitud, corrigiendo los errores de secuenciación mediante diferentes enfoques de eliminación de ruido o denoising, siendo estas unidades taxonómicas más precisas que las originales para determinar la composición microbiana de las muestras basadas en el amplicón 16S. Análisis de la microbiota de los efluentes tratados de una mina de cobre sobre el río Jinsha (China) Para el ejemplo E1, se obtuvieron 1’756,938 lecturas totales para el conjunto de las 36 muestras secuenciadas y un total de 1,310 ZOTUs identificados una vez filtradas las secuencias, siendo el número de medio de ZOTUs por muestra de 754 (± 203) unidades taxonómicas. El índice de Good Coverage fue del 99.6%, confirmando una buena secuenciación de las muestras. El porcentaje de identificación taxonómica alcanzado a nivel de género fue del 81.1%, es Figura 5. Abundancia relativa observada (%) de los filos bacterianos de muestras de sedimentos de la mina de carbón de la región de Mpumalanga (Sudáfrica). Cada barra vertical representa una muestra (N=66) y están agrupadas bajo los cuatro periodos temporales. Se presentan los filos más abundantes en todas las muestras y los taxones con una abundancia global inferior al 1% conforman una sola categoría nombrada como “Otros” (en gris). No se incluye los taxones no informativos.

MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 19 decir, se consiguió poner una etiqueta taxonómica mediante nuestro pipeline más del 80% de los ZOTUs a nivel de género, permitiendo tener una muy buena caracterización de la composición microbiológica de las comunidades detectadas en estas muestras de drenaje alcalinizado, proveniente de una mina de cobre en China. En las Figuras 1 a la 3, se visualizan los resultados de la composición microbiana de las 36 muestras a estudio, con respecto a filum, familia y género. Para mejorar su comprensión, se creó una categoría que recogió a todos aquellos taxones cuya proporción global fuese inferior al 1% además de excluir en la estimación de la abundancia relativa a aquellos taxones sin taxonomía informativa. Se observa que las muestras provenientes de las zonas no contaminadas (aguas arriba del río, en el artículo original identificadas con NR) presentaron una composición microbiológica diferente al resto de muestras. Los análisis de abundancia taxonómica determinó que el 99.6% de los ZOTUs detectados de media en el total de las muestras fueron clasificados como bacterianos y solo un 0.3% como arqueas. Un total de 26 filos distintos fueron detectados, destacando el filo Proteobacteria con una proporción media del 54.5%, seguido de Firmicutes (31.5%), Bacteroidetes (5.1%) y Actinobacteria (3.2%). Los géneros más abundantes de los 80 detectados fueron: exiguobacterium (34.7%), acinetobacter (18.5%), citrobacter (11.7%) de media para el conjunto total de las muestras; el segundo y tercer género también fueron reportados por el artículo de Qiusheng (2021). Asimismo, el género thiobacillus en las muestras contaminadas fue detectado con un 4.8% de abundancia media y en las muestras sin contaminar se obtuvo una abundancia media del 1.4%. Otros géneros interesantes que aparecen tanto en el artículo original como en este reanálisis fueron el género thiovirga, que en el estudio original se asoció a las muestras contaminadas, en este reanálisis, también apareció este género en abundancia en las muestras contaminadas, más concretamente, en las pertenecientes al canal de la poza, así como aguas abajo del río (5.3% y 7.4% de abundancia media, respectivamente) frente al grupo de muestras no contaminadas (aguas arriba del río) con menos del 0.3%. Otro género asociado a la condición de contaminación fue symbiobacterium, sin embargo, en nuestro reanálisis apenas fue detectado en las muestras obteniendo una abundancia media menor del 0.1%. En cuanto a la condición de “no contaminación” se corroboró la presencia del género chryseobacterium también en nuestro reanálisis (1.3%), la presencia del género GOUTA19 (orden Nitrospirales) (0.5%), la presencia del género nitrososphaera (0.3%) y planctomyces (0.3%), sin embargo, como ocurre con el anterior género, también se han identificado en muy baja abundancia. En nuestro reanálisis, destacaron los géneros burkholderia y flavisolibacter respecto a su abundancia en relación con los sitios no contaminados (3.6% y 5.2%, respectivamente), el género hydrogenophaga relacionado con los sitios contaminados (4.6%) y el género sulfurospirillum que destacó en las muestras de la poza (3.2%). En cuanto a la diversidad, se observó una mayor riqueza en las muestras no contaminadas respecto a las contaminadas, corroborando lo manifestado en el artículo original (Qiusheng et al., 2021). En la Tabla 1, se describen las estimaciones medias de los índices de alfa-diversidad calculados en este reanálisis: riqueza (S), índice de Shannon-Weiner (H) y el índice de Simpson (1-D). Se advierte que las muestras no contaminadas presentaron una mayor riqueza como diversidad respecto al resto, mientras que las muestras de la poza fueron las que menor riqueza y diversidad obtuvieron.

MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 20 Comparando las poblaciones bacterianas de las muestras de zonas contaminadas y las aguas río arriba, se encontraron diferencias significativas (p < 0.001, Permanova). Esto se puede visualizar en la Figura 4, que agrupa las muestras según la similitud de sus poblaciones y, claramente, se observa que las muestras contaminadas se diferencian de las no contaminadas. No solo se puede diferenciar entre el agua contaminada y la limpia, sino que además, se pudo hallar diferencias estadísticamente significativas (p < 0.020, Permanova) entre el grupo compuesto por el agua de la poza alcalina y el canal que la vierte al río, y el agua del río cauce debajo de la mina corrigiendo por comparaciones múltiples. Esto es fácilmente explicable, ya que el caudal no contaminado del río se mezcla con el agua contaminada, diluyéndola. Sin embargo, queda claro que la población bacteriana del agua cauce debajo de la mina es más similar al agua de la poza alcalina que a la del caudal no contaminado del río. Análisis de la microbiota de las minas de carbón de Mpumalanga (Sudáfrica) Se obtuvieron 1’422,360 lecturas totales para el conjunto de las 66 muestras secuenciadas y un total de 4,961 ZOTUs identificados una vez filtradas las secuencias, siendo el número de medio de ZOTUs por muestra de 1,489 (± 656) unidades taxonómicas. El índice de Good Coverage fue del 94.6%, confirmando una buena secuenciación de las muestras de manera global. Sin embargo, en cuanto a la identificación taxonómica tuvo peor rendimiento a diferencia del estudio previo, ya que solo se consiguió identificar a nivel de género el 17.5% de los ZOTUs. Prácticamente, el total de los ZOTUs detectados en las muestras corresponden a la clasificación de bacteria. Los filos más abundantes de media fueron Actinobacteria (32.5%), Proteobacteria (16.9%), Planctomycetes (16.3%) y Chloroflexi (14.0%). Estos filos también fueron detectados en el artículo original. En cuanto a los géneros más abundantes de media en el conjunto de los Figura 6. Abundancia relativa observada (%) de las familias bacterianas de muestras de sedimentos de la mina de carbón de la región de Mpumalanga (Sudáfrica). Cada barra vertical representa una muestra (N=66) y están agrupadas bajo los cuatro periodos temporales. Se presentan las familias más abundantes en todas las muestras y los taxones con una abundancia global inferior al 1% conforman una sola categoría nombrada como “Otros” (en gris). No se incluye los taxones no informativos.

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MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 22 datos fueron sphingomonas (13.1%), bradyrhizobium (8%), el género DA101 (filo Verrucomicrobia) (7.8%) y mycobacterium (7.3%). Destacando el género sphingomonas relacionado con la recircularización de los elementos químicos esenciales en los suelos agrícolas. En las Figuras 5 a la 7 se muestran los resultados con respecto a filum, familia y género de este análisis, agrupando las muestras por periodos de años. Las tres minas fueron reclamadas en periodos diferentes, lo que permitió encontrar una relación entre el tiempo transcurrido desde que la tierra fue reclamada y la diversidad bacteriana del terreno. Si bien, en cuanto riqueza, los sitios reclamados tuvieron una mayor riqueza media de especies respecto a las zonas naturales, se halló una tendencia al alza de la riqueza entre los sitios reclamados en correlación con el aumento del periodo transcurrido de la reclamación de la mina, es decir, se observó un aumento de la riqueza a medida que aumentaba el periodo de reclamación (Tabla 2). Esta misma tendencia se puede observar en los índices de diversidad Shannon y Simpson, de manera que a medida que aumentó el periodo de reclamación, se incrementó la diversidad en las muestras. Los resultados del análisis realizado indican que hay una relación positiva entre la diversidad del terreno y el tiempo transcurrido desde que empezó su rehabilitación. Las métricas de diversidad riqueza, según Shannon y Simpson, reflejan una tendencia logarítmica, es decir, la diversidad del terreno crece rápido los primeros 10 años desde la rehabilitación del terreno, y más adelante continúa aumentando a menor ritmo según esta diversidad se estabiliza a un nivel sano (Figura 8). Comentarios finales El análisis metagenómico permite establecer cómo es la diversidad de los microorganismos en ambientes afectados por la actividad minera y su comparación con ecosistemas no afectados o sometidos a procesos de remediación o rehabilitación. Los dos ejemplos analizados en el presente trabajo dan cuenta de ello, para dos aspectos muy comunes desde la perspectiva ambiental del negocio minero, como lo son el tratamiento de aguas de mina y la rehabilitación de suelos. El primer análisis realizado (E1), sobre muestras tomadas en diferentes lugares relacionados con un sistema de tratamiento de aguas de mina (Qiusheng et al., 2021), mostró como la descarga del efluente tratado en un río afectaba la diversidad microbiológica, tanto dentro del propio sistema de tratamiento como aguas arriba como aguas abajo del punto de vertimiento. A pesar de tratarse de un sistema muy común de tratamiento pasivo de aguas ácidas (pozas de sedimentación alcalinas), se apreciaron diferencias estadísticamente significativas al comparar con los puntos aguas arriba del lugar de vertimiento. Entre la población bacteriana de las aguas contaminadas se encuentran varios taxones que actúan como indicadores de los desechos metálicos y de azufre en el agua, como son bacterias de los géneros thiovirga y thiobacillus, las cuales están involucradas en la oxidación del azufre; y symbiobacterium y alishewanella, las cuales son muy resistentes a las altas concentraciones de elementos metálicos como el cobre y el manganeso. Esto indica que la población microbiológica de un ecosistema es un fiel marcador de su salud, y los cambios producidos por esta mina de cobre muestran su gran efecto en el río, a pesar de que su caudal sea mucho mayor que el agua contaminada vertida en él. Por su parte, en el segundo análisis (E2), se observan las diferencias en términos de diversidad microbiana de suelos rehabilitados en minas de carbón cerradas, a lo largo de un período de 24 años en Sudáfrica (Ezeokoli et al., 2020). Los resultados encontrados en este caso resultan muy interesantes, ya que más allá de recuperarse la diversidad bacteriana de la tierra, la mayoría de las muestras de más de 15 años

MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 23 superan la diversidad media de las muestras de tierras vírgenes cercanas a las zonas de actividad minera. Esto puede deberse a múltiples factores, entre ellos el hecho de que las operaciones de rehabilitación en dichos sitios involucraron labores de fertilización y colonización del suelo con diversas especies de gramíneas (Ezeokoli et al., 2020), lo cual acabó por producir un ecosistema más variado que el originalmente encontrado en dichos lugares, antes de la actividad minera. Esto constituye un poderoso ejemplo de cómo puede medirse cuantitativamente, de una manera muy precisa, el incremento de la capacidad de prestación de servicios ecosistémicos de los suelos de un área rehabilitada luego de la explotación minera, empleando para ello herramientas metagenómicas. En conclusión, la metagenómica constituye una herramienta novedosa que permite visualizar de una manera efectiva cómo son los ecosistemas microbianos en un ambiente afectado por la minería y que posibilita evaluar de forma realista la salud de dichos ecosistemas y la eficacia de los procedimientos de remediación ambiental asociados con procedimientos de cierre de minas. Bibliografía Anderson, M.J. 2001. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral Ecology, 26: 32-46. Doi: 10.1111/ j.1442-9993.2001.01070.pp.x Andrews, S. 2010. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. Available online. https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ Bell, T.H., Joly, S., Pitre, F.E., y Yergeau, E. 2014. Increasing phytoremediation efficiency and reliability using novel omics approaches. Trends in Biotechnology, 32(5): 271-80. Doi: 10.1016/j.tibtech.2014.02.008. Epub 2014 Apr 12. PMID: 24735678. Bender, J., Duff, M.C., Phillips, P., y Hill, M. 2000. Bioremediation and Bioreduction of Figura 7. Abundancia relativa observada (%) de los géneros bacterianos de muestras de sedimentos de la mina de carbón de la región de Mpumalanga (Sudáfrica). Cada barra vertical representa una muestra (N=66) y están agrupadas bajo los cuatro periodos temporales. Se presentan los géneros más abundantes en todas las muestras y los taxones con una abundancia global inferior al 1% conforman una sola categoría nombrada como “Otros” (en gris). No se incluye los taxones no informativos.

MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 24 Dissolved U(VI) by Microbial Mat Consortium Supported on Silica Gel Particles. Environmental Science & Technology, 34(15): 32353241. Doi: 10.1021/es9914184. Bender, J., y Phillips, P. 2004. Microbial mats for multiple applications in aquaculture and bioremediation. Elsevier Ltd, Oxford. Disponible en: https://dx.doi.org/10.1016/j. biortech.2003.12.016 doi: 10.1016/j.biortech.2003.12.016. Bhatt, P., Bhatt, K., Sharma, A., Zhang, W., Mishra, S., y Chen, S. 2021. Biotechnological basis of microbial consortia for the removal of pesticides from the environment. Informa UK Limited, (-03-17) doi:10.1080/07388551.2020. 1853032. Bray J.R., Curtis J. T. 1957. An ordination of upland forest communities of southern Wisconsin. Ecological Monographs 27:325-349. Callahan, B. J., McMurdie, P. J. & Holmes, S. P. 2017. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. The ISME journal 11, 2639–2643. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. 2018. Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor, Bioinformatics, Vol 34, Issue 17, 884– 890 1. Claesson M, O'Sullivan O, Wang Q, Nikkilä J, Marchesi J, Smidt H, de Vos W, Ross R, O'Toole P. 2009. Comparative Analysis of Pyrosequencing and a Phylogenetic Microarray for Exploring Microbial Community Structures in the Human Distal Intestine. PLoS ONE 4:e6669. Cohen, Y. 2002. Bioremediation of oil by marine microbial mats. International Microbiology, 5(4): 189-193. Doi: 10.1007/s10123002-0089-5. Daly, A., Baetens, J., De Baets, B. 2018. Ecological Diversity: Measuring the Unmeasurable. Mathematics 6:119. DeSantis, T. Z. et al. 2006. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with arb. Appl. Environ. Microbiol. 72, 5069–5072. Dixon, P. 2003. VEGAN, a package of R functions for community ecology. Journal of Vegetation Science 14:927-930. Dos Santos, E.C., de Mendonca Silva, J.C., y Duarte, H.A. 2016. Pyrite Oxidation Mechanism by Oxygen in Aqueous Medium. The Journal of Physical Chemistry C, 120:2760−2768. Disponible en: https://doi.org/10.1021/acs. jpcc.5b10949. Durán, P., Thiergart, T., Garrido-Oter, R., Agler, M., Kemen, E., Schulze-Lefert, P., Hacquard, S. 2018. Microbial Interkingdom Interactions in Roots Promote Arabidopsis Survival. Cell, 175 (4): 973-983.e14. Doi: 10.1016/j. cell.2018.10.020. Edgar, R. C. 2018. Updating the 97% identity threshold for 16S ribosomal rna otus. Bioinformatics 34, 2371–2375. Edgar, R. C. 2010. Search and clustering orders of magnitude faster than blast. Bioinformatics 26, 2460–2461. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C. & Knight, R. 2011. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics 27, 2194–2200. Edgar, R. C. 2016. UCHIME2: Improved chiTabla 2. Estimaciones de los Índices de Diversidad Alfa Determinados por Periodos de Reclamación (media [± desviación estándar]) Periodos de Reclamación S H 1-D 0 - 8 años 1293 (± 578) 5.94 (± 0.93) 0.99 (± 0.01) 9 - 18 años 1749 (± 608) 6.30 (± 0.92) 0.99 (± 0.02) 19 - 24 años 1915 (± 220) 6.74 (± 0.12) 1.00 (± 0.00) Tierra virgen 1149 (± 727) 5.75 (± 1.05) 0.99 (± 0.02)

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MINERÍA la mejor puerta de acceso al sector minero MINERÍA / AGOSTO 2022 / EDICIÓN 539 26 mera prediction for amplicon sequencing. BioRxiv 074252. Edgar, R. C. 2016. UNOISE2: Improved error-correction for illumina 16S and its amplicon sequencing. BioRxiv 081257. Edgar, R. 2016. SINTAX: A simple non-bayesian taxonomy classifier for 16S and its sequences. BioRxiv 074161. Ehrlich, H. 1999. Past, present and future of biohydrometallurgy. Process Metallurgy, 9: 3-12. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/ s1572-4409(99)80002-9. Epelde, L., Lanzén, A., Blanco, F., Urich, T., y Garbisu, C. 2015. Adaptation of soil microbial community structure and function to chronic metal contamination at an abandoned Pb-Zn mine. FEMS Microbiology Ecology 91(1): 1-11. Doi: 10.1093/femsec/fiu007. Epub 2014 Dec 5. PMID: 25764532. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S. & Käller, M. 2016. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics 32, 3047–3048. Ezeokoli, O.T., Bezuidenhout, C.C., Maboeta, M.S. et al. 2020. Structural and functional differentiation of bacterial communities in post-coal mining reclamation soils of South Africa: bioindicators of soil ecosystem restoration. Scientific Reports 10, 1759. Doi: 10.1038/s41598020-58576-5 Fedor, P., Zvaríková, M. 2019. Biodiversity indices, p. 337–346. In Fath, B (ed.), Encyclopedia of Ecology, 2nd ed. Elsevier, Amsterdam. Fierer N. 2017. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 2017 Oct; 15 (10):579590. Doi: 10.1038/nrmicro.2017.87. Epub 2017 Aug 21. PMID: 28824177. Filiatrault, M.J. 2011. Progress in prokaryotic transcriptomics. Current Opinion in Microbiology, 14 (5): 579–86. doi:10.1016/j. mib.2011.07.023. PMID 21839669. Geetha, M., y Fulekar, M.H. 2016. Bioremediation of pesticides in surface soil treatment unit Figura 8. Índices de diversidad-alfa de riqueza observada, Shannon, y Simpson respectivamente. Se puede observar que los tres siguen una tendencia logarítmica, creciendo rápido al principio y estabilizándose a partir de los 8 a 10 años.

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